Цитоэмбриологическая характеристика формирования мужского и женского гаметофитов у двух тетраплоидных форм яблони - доноров диплоидных гамет для селекции на полиплоидном уровне
ART 54325
УДК
001
Н.
Г. ГорбачеваБиблиографическое описание статьи для цитирования:
Горбачева
Н.
Г.,
Седышева
Г.
А.,
Седов
Е.
Н. Цитоэмбриологическая характеристика формирования мужского и женского гаметофитов у двух тетраплоидных форм яблони - доноров диплоидных гамет для селекции на полиплоидном уровне // Научно-методический электронный журнал «Концепт». –
2014. – Т. 20. – С.
326–330. – URL:
http://e-koncept.ru/2014/54325.htm.
Аннотация. В статье приводится цитоэмбриологическая характеристика генеративных структур двух тетраплоидных форм яблони – доноров диплоидных гамет. Несмотря на ряд нарушений в ходе мейоза при микроспорогенезе, формировании женского гаметофита у полиплоидов 25-37-47 (4х) и 30-47-88 (4х) формируется достаточное количество морфологически нормальной пыльцы и правильных семяпочек с развитыми зародышевыми мешками, что делает их пригодными для использования в селекции яблони на полиплоидном уровне. И как носители генов иммунитета к парше (Vm, Vf ), они представляют большую ценность для получения высокоустойчивых и иммунных триплоидных сортов яблони, способных давать экологически чистую продукцию.
Текст статьи
Горбачева Наталья Геннадьевна,кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник, ГНУ «Всероссийский научноисследовательский институт селекции плодовых культур Российской академии сельскохозяйственных наук», г. Орел
gorbachevanata81@yandex.ru
Седышева Галина Алексеевна,доктор сельскохозяйственных наук, зав. лаборатории Цитоэмбриологии, ГНУ «Всероссийский научноисследовательский институт селекции плодовых культур Российской академии сельскохозяйственных наук», г. Орел
info@vniispk.ru
Седов Евгений Николаевич,доктор сельскохозяйственных наук, академик ГНУ «Всероссийский научноисследовательский институт селекции плодовых культур Российской академии сельскохозяйственных наук», г. Орел
info@vniispk.ru
Цитоэмбриологическая характеристика формирования мужского и женского гаметофитов у двух тетраплоидных форм яблони –доноров диплоидных гамет для селекции на полиплоидном уровне
Аннотация.В статье приводится цитоэмбриологическая характеристика генеративных структур двух тетраплоидных форм яблони –доноров диплоидных гамет. Несмотря на ряд нарушений в ходе мейоза при микроспорогенезе, формированииженского гаметофитау полиплоидов 253747 (4х) и 304788 (4х) формируется достаточное количество морфологически нормальной пыльцы и правильных семяпочек с развитыми зародышевыми мешками, что делает их пригодными для использования в селекции яблони на полиплоидном уровне. И как носителигенов иммунитета к парше (Vm, Vf) они представляют большую ценностьдля получениявысокоустоичивых ииммунных триплоидных сортов яблони, способных давать экологически чистую продукцию.Ключевые слова: яблоня, селекция, полиплоидия, доноры диплоидных гамет, пыльца, зародышевый мешок.
Возрастающее действие стрессов среды приводит к неблагоприятной экологической обстановке и, как следствие –к снижению адаптивности сортов плодовых культур. В результате ухудшается товарность и пищевые качества плодов. Это заставляет предъявлятьк новым сортам все возрастающие требования: наряду с высокими показателями качества плодов, они должны обладать устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам среды, соответствовать требованиям интенсивных технологий. Использование в селекции плодовых растений в качестве исходных форм полиплоидов дает возможность увеличить диапазон генетического разнообразия гибридного потомстваи повысить вероятность получения новых форм, отвечающих требованиям интенсивного адаптивного садоводства, тем более после вступления России во Всемирную Торговую Организацию, когда ужесточились условия существования российского товаропроизводителя на рынке садоводческой продукции. Повышение конкурентоспособности возможно за счёт внедрения различных инновационных технологий возделывания плодовоягодных культур, в которых центральная роль отводиться сортименту, пригодности сортов к интенсивному возделыванию. Современные технологии требуют современных сортов. Повышение рентабельности производства ивместе с тем снижение негативного воздействия на экологию –должны стать неотъемлемыми требованиями в современномсадоводстве.Яблоня является одной из важнейших плодовых пород в зоне с умеренным климатом. Несомненный интерес для практического садоводствапредставляют триплоидные сорта яблони, которые обладают комплексом хозяйственноценных признаков: более крупные плоды, более регулярное плодоношение, лучшая товарность и транспортабельность плодов, более высокая самоплодность, устойчивость к болезням, высокое содержание витаминов. Они в значительной степени отвечают возрастающим требованиям рынка[1, 2, 3].
Селекция растений одна из основных составляющих успешного развития производства сельскохозяйственной продукции. Процесс создания новых форм растений базируется на генетическом разнообразии растений и методах его использования селекционерами[4].Получение новых адаптивных триплоидных сортов –важное направление исследований во ВНИИСПК в рамках программы по селекции яблони на полиплоидном уровне. Целенаправленная селекция яблони на полиплоидном уровне –принципиально новый и эффективный метод в селекции. Группой учёных под руководством академика Седова Е.Н. впервые в России и в мире полученаот целенаправленных скрещиванийсерия триплоидных сортов(Масловское, Августа, Дарёна, Бежин луг, Орловский партизан и др.), отличающихся повышенными адаптивными и хозяйственно ценными свойствами[5].Наиболее эффективным методом создания большого гибридного фонда триплоидов яблони является скрещивание разнохромосомных форм типа: диплоид х тетраплоид, тетраплоид х диплоид. Чтобы обеспечить широкий спектр генетического разнообразия триплоидных гибридов необходимо располагать большим набором тетраплоидных форм –доноров диплоидных гамет. Ограниченный набор таких форм является сдерживающимфактором для этого направления селекции. Поэтому выделение новых тетраплоидных форм яблони, изучение цитоэмбриологических особенностей их генеративной сферы, необходимы для рациональной постановки селекционных работ и для прогнозирования результатов этих работ.Объекты и методика исследований.Объектамиисследований послужили две тетраплоидныеформы яблони, содержащие в своем генотипе гены иммунитета к парше.Полученные во ВНИИСПК в отделе селекции яблони.
1. 304788[Либерти × 136106 (сеянец сорта Суворовец)] (4х)
Тетраплоид имеет в своем генотипе ген иммунитета к парше Vf.Плоды у формы 304788 зимнего срока созревания, выше средней массы (180г) (рис. 1).Мякоть плодов зеленоватая, плотная, сочная, кислосладкого вкуса. Химическийсостав плодов: сахара –9,9%, кислота –0,56%, аскорбиновая кислота –6,1мг/100 г. Внешний вид и вкус плодов оцениваются на 4,3 балла.
Рисунок 1
Плодоношение тетраплоидной формы яблони 3047882. 253747 (SR0523 × Антоновка плоская)(4х) –тетраплоидная форма яблони, содержитв своем геноме ген иммунитета Vm(рис. 2).
Рисунок 2
Плоды тетраплоидной формы яблони 253747Цитоэмбриологическая часть работы проводилась в лаборатории цитоэмбриологии ВНИИСПК. Временные препараты для изучения мейоза при микроспорогенезе готовили ацетогематоксилиновым методом [6]. Цветковыепочки фиксировали в уксусном алкоголе (3:1). Фиксация темпоральная на протяжении нескольких дней с момента появления зеленого конуса и до распускания цветка.Постоянные препараты,для изучения женской генеративной сферы, делали в соответствии с общепринятой методикой[7, 8].Срезыизготовляли толщиной 25 мкм. Препараты красили гематоксилином по Гейденгайну.
Для кариологических исследований (плоидность гибридного потомства) применялся пропионоволакмоидный метод [9, 10 11].Прямой подсчет числа хромосом осуществлялся на давленых препаратах из меристем и молодых листочков точек роста.Исследования проводилис использованием микроскопа Nikon50i, Biolar, при увеличении 10 х 1,5 х 40; 10 х 1,5 х 100.Результаты исследований. Так как тетраплоидные формы яблони 304788 и 253747 являются исходным материалом для селекции,важно знать качество формируемых ими гамет.Проследив ход мейоза у этих формследует отметить, что на всех стадияхприсутствуют отклонения от нормы.Процент микроспороцитов саномальными картинами деленияварьирует в зависимости от стадии мейоза и формы.Более правильный ход мейоза утетраплоида 253747(9,134,1%)(рис.3),у формы 304788 процент нарушений выше от 19,9до 51,3% (таблица 1).Абсолютное большинство микроспороцитов с нормальной картиной деления: от 77,5 до 90,9% у формы 253747 и от 48,7 до 80,1%уформы 304788.Таблица 1Характеристика мейоза при микроспорогенезе у тетраплоидных форм яблони
формаСтадия мейоза МетафазаIАнафазаIТелофазаIМетафазаIIАнафазаIIТелофазаIIТетрады% нарушений253747 (4х)17,534,19,122,522,58,710,9304788 (4х)38,744,119,951,332,527,746,4
абв
где
жз
Рисунок 3Нормальный микроспорогенез у тетраплоидной формы яблони253747а–метафазаI; б –анафазаI; в –телофазаI; г –метафазаII; д –анафазаII; е –телофазаII; ж –тетрады; з –пыльца.Отмеченаобщая направленность микроспорогенеза (рис.4). Можно отметить, что у данныхформ количество нарушений от метафазыIвозрастает к анафазеI, в телофазеIснижается, но уже в метафазеIIчисло аномальных микроспороцитов вновь увеличивается, в анафазеIIу формы 304788 постепенно снижается, а у формы 253747 остается на том же уровне. К моменту завершения мейоза, в телофазеIIу обеих форм количество нарушений уменьшается, но на стадии тетрад незначительно увеличивается(рис. 4).
Рисунок 4
Ход мейоза у тетраплоидных форм яблониСпектр разнообразия типов нарушений в ходе микроспорогенеза у формы 304788 более разнообразный (до 9 типов), чем у формы 253747(23 типа). К окончаниюмикроспорогенезаколичество типов нарушений снижается до двух(рис. 5, таблица 2).
Рисунок 5
Количество типов нарушений у тетраплоидных форм яблони
Таблица 2Морфология нарушений в ходе мейоза у тетраплоидных форм яблони Стадия мейозаформа304788 (4х)253747 (4х)МетафазаI–забегание отдельных хромосом или групп хромосом к полюсам веретена деления; –выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;–микроверетено; –диффузное распределение хромосом; –отсутствие хроматина; –забегание отдельных хромосом или групп хромосом к полюсам веретена деления; –выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;
АнафазаI
–отставание отдельных хромосом в центре веретена;–выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;–мост;–сверхчисленные веретена;–отсутствие хроматина; –отставание отдельных хромосом в центре веретена;–мост;
ТелофазаI–микроядра, сверхчисленные ядра–микроядра, сверхчисленные ядра;–мост;МетафазаII–забегание отдельных хромосом или групп хромосом к полюсам веретена деления;–выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;–забегание отдельных хромосом или групп хромосом к полюсам веретена деления;–выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;
–диффузное распределение хромосом; –сверхчисленные веретена; –неравные веретена деления;–асинхронность деления; –дегенерация хроматина;–отсутствие хроматина; –комбинацияиз двух типов нарушений;–комбинация из двух типов нарушений;АнафазаII–отставание отдельных хромосом в центре веретена;–выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;–мост;
–сверхчисленные веретена;
–неравные веретена деления; –комбинация из двух типов нарушений;–отставание отдельных хромосом в центре веретена;–сверхчисленные веретена;–комбинация из двух типов нарушений;ТелофазаII–микроядра, сверхчисленные ядра;
–асинхронность деления;
–дегенерация хроматина;–микроядра, сверхчисленные ядра;–мост;Тетрады–пентада; –гексада;
–гептада.–пентада; –гексада;
При сравнении между собой морфологии нарушений у тетраплоидных форм яблони 304788 и 253747 можно отметить общие для них типы нарушений. Так на стадии метафазаI–это преждевременное забегание отдельных хромосом к полюсам веретена деления(рис. 6а), выброс их за пределы ахроматинового веретена. На стадии анафазаIотставание хромосом в центре веретена деления(рис. 6б), выбросы, мосты(рис. 6в). В телофазеIприсутствие микроядер и сверхчисленных ядер(рис. 6г). У формы 253747 в отдельных микроспороцитах между ядрами сохраняются мостыв виде нитей, сформировавшихся еще на предыдущих стадиях(рис. 6и). Длястадии метафазыIIхарактерно наличие микроспороцитов с забеганиями хромосом(рис. 6д), выбросами(рис. 6е), встречаются комбинации из нескольких типов нарушений в одном микроспороците.На стадии анафазаIIраспространенный тип нарушений –отставание хромосом в центре веретена деления(рис. 6ж), наличие трех, четырех веретен деления, вместо двух (норма).ТелофазаIIхарактеризуется наличием таких аномалий, как микроядра и сверхчисленные ядра(рис. 6з). Вследствиеэтого на стадии тетрад образуются полиадыспорады с большим количеством микроспор: пентады, гексады, гептады(рис. 6к).На стадии тетрад основная масса клеток представлена правильными тетрадами (253747 –89,1%, 304788 –53,6%), распадающимися после созревания на нормальные микроспоры(рис. 3ж).Кроме общих для этих форм нарушений, у формы304788 на разных стадиях отмечены своианомалии:в анафазе IиIIдополнительные веретена делений, сформировавшиеся из групп хромосом, выброшенных в цитоплазму микроспороцита на предыдущих стадиях деления и микроспороциты без хроматина.Вметафазе II
диффузное распределение хромосом, неравные веретена, асинхронность деления, в некоторых микроспороцитах хроматин подвергался дегенерацииили отсутствовал вовсе.
абв
где
жзи
к
л
Рисунок 6
Нарушения в микроспорогенезе у тетраплоидных форм яблониа–метафазаI, забегание хромосом (253747); б –анафазаI, оставание хромосом (304788);в анафазаI, мост (304788); г–телофазаI, микроядро (304788); д–метафазаII, забегание хромосом (304788); е метафазаII, выброс хромосом (253747); ж анафазаII, отставание хромосом (253747); з телофазаII, микроядра (253747); и –телофазаII, мост (253747); к –гексада(304788);
л –пыльца (304788)
К моменту окончания мейоза часть нарушений нивелируется и у тетраплоидов 304788 и 253747 формируется 49,9% и 70% соответственно, морфологически нормальной пыльцы, что позволяет использовать их в селекции в качестве доноров диплоидных гамет.
Скрещиваниятипа 2х х 4х с участием изученных форм, взятых в качестве опылителей, показали высокий выход триплоидных растений в гибридных семьях (таблица –2).
Таблица2Плоидность гибридных сеянцев яблони от разнохромосомных скрещиваний
Гибридная семья (2х х 4х)
Тип скрещиванияКолво изученных сеянцевВтом числедиплоидышт./%триплоидышт./%Антоновка обыкновенная (2х) х 304788 (4х)2х × 4х12049/40,871/59,2Синап Орловский (2х) х 304788(4х)2х × 4х8
8/100Краса Свердловска (2х) х 304788 (4х)2х × 4х7713/16,964/83,12314122 (2х) х 253747(4х)2х × 4х6510/15,455/84,6
Развитие женского гаметофита у тетраплоидных форм яблони 304788 и 253747 идет по одной схеме. Весной происходит формирование семяпочек. В них дифференцируется овальный нуцеллус, одетый внутренними и внешними интегументами. В нуцеллусе закладывается материнская клетка макроспор, из нееразвивается тетрада и формируется зародышевый мешокдвух, четырехи,наконец,восьмиядерный. Эмбриональные структуры зародышевого мешка дифференцируются,и все его элементы приобретают типичное для яблони строение.Изученные формы характеризуются довольно мощным археспориальным комплексом, максимальное число клеток которого достигает 15 –у формы 304788 и 13 –у 253747. Преобладают линейные тетрады макроспор(рис. 7а). Отмечено одновременное развитие двухчетырех дополнительных тетрад(рис. 7б). Объяснить это можно высокой степенью активности женского археспория(рис. 7в). Но при развитии нормального зародышевого мешка активность его затухает. Поэтому только единождыбыло отмечено развитие дополнительного зародышевого мешка.
абв
Рисунок 7
Особенности формирования женского гаметофитаа линейная тетрада, 304788; б дополнительные тетрады, 253747; в две клетки активного археспория, 253747Зрелый зародышевый мешок яйцевидноудлиненной формы, расширенный в микропилярной и зауженный в халазальной части. Клетки яйцевого аппарата грушевидной формы, яйцеклетка содержит крупное ядро. Вблизи яйцевого аппарата находятся полярный ядра. В халазальном конце зародышевого мешка расположены небольшие угловатые клетки –антиподы, которые дегенерируют к моменту созревания зародышевого мешка(рис.8).
абв
Рисунок 8
Дифференцированный восьмиядерный зародышевый мешок, 253747(4х)
а –яйцеклетка; б –синергиды, полярные ядра; в –антиподы.Из аномалий женского гаметофита отмечено: дифференциация всех клеток яйцевого аппаратапо типусинергид(рис. 9а), три клетки антиподы так же могут быть дифференцированы как синергиды. Встречаются многоядерные зародышевые мешки, с количеством ядер от 10 до 18, вместо положенных восьми(рис. 9 б, в). По всей вероятности это связано с расщеплением веретена деления. Дополнительные ядра могут располагаться в разных участках зародышевого мешка, часто эти ядра неправильной формы и разного размера.
абв
Рисунок 9
Аномалииразвития женской генеративной сферыа–
дифференциация клеток яйцевого аппарата по типу синергид (253747); б– пять ядер в микропилярном конце зародышевого(304788); в– пять ядер в халазальномконце зародышевого мешка(304788).Минимальный уровень аномальных зародышевых мешков (21,9%) и семяпочек(2,9%) отмечен у формы 253747. Чуть больше отклонений у формы 304788–это 27,8% аномальных зародышевых мешков и 21,5% аномальных семяпочек (сложные семяпочки, с двумя, тремя нуцеллусами, причем в каждом нуцеллусе развивается свой зародышевый мешок, сидячие семяпочки с недоразвитым фуникулюсом, уродливые мелкие семяпочки с недоразвитыми интегументами)(рис. 10, 11). В некоторых семяпочках происходит дегенерация генеративной ткани.
Рисунок 10
Количество типов нарушений у тетраплоидных форм яблони
абвРисунок 11
Аномалии в развитии семяпочек, 304788 (4х)а –сложная семяпочка с тремя нуцеллусами;
б – сидячая семяпочка с одним интегументом; в –уродливая семяпочка, наружный интегумент растет сам по себе
Тем не менее, несмотря на некоторые отклонения в развитии женского гаметофита, у форм 304788 и 253747 развивается достаточное количество нормальных семяпочек, а на стадии распустившегося цветка присутствуют восьмиядерные зародышевые мешки Polygonumтипа(рис. 12). Следовательно, изученные тетраплоидные формы яблони могут быть привлечены в селекцию на полиплоидном уровне в качестве материнского компонента.
Рисунок 12
Нормальная семяпочка, содержащая восьмиядерный зародышевый мешок , 304788 (4х)Таким образом, проведенные исследованияпо изучениюгенеративной сферы позволяют сделать выводо пригодности использования тетраплоидных форм яблони 304788 и 253747, как доноровдиплоидных гамет в селекции и как опылителей и как материнских исходных формдля получения высокоэффективных, адаптивных триплоидных сортов яблони, отвечающих требованиям современного интенсивного садоводства. А наличие у этих форм генов иммунитета к парше Vf
(304788) и Vm(253747) делает их ценными донорами селекционно значимых признаков, ииспользование ихв селекцииоткрывает большие возможности для создания адаптивных триплоидных сортов, иммунных к парше, способных давать экологически чистуюпродукцию.
Ссылки на источники1.Седов Е. Н. Селекция и сортимент яблони для Центральных регионов России / Е. Н. Седов.Орел: ВНИИСПК, 2005. –312 с.2.Седов Е. Н. Селекция и новые сорта яблони / Е. Н. Седов.Орел: ВНИИСПК, 2011. –624 с.3.Седов, Е. Н. Новые иммунные / Е. Н. Седов, Г. А. Седышева, З. М. Серова // Приусадебное хозяйство. –2005. № 12. –С. 4647.4.Вавилов, Н.И. Теоретические основы селекции. М.: Наука, 1987. 511 с.5.Седов, Е. Н. Селекционная оценка гетероплоидных скрещиваний при создании триплоидных сортов яблони / Е. Н. Седов, Г. А. Седышева, З. М. Серова, Н. Г. Горбачева, С. А. Мельник // Вавиловский журнал генетики и селекции. –2013. №3. –Т 17. –С. 499507.6.Топильская, Л. А. Изучение соматических и мейотичеоких хромосом смородины на ацетогематоксилиновых давленых препаратах / Л. А. Топильска, С. В. Лучникова, Н. П. Чувашина // Бюллетень ЦГЛ им. И. В. Мичурина, 1975. –Вып. 22. –С. 5861.7.Рыбин, В. А. Цитологический метод в селекции плодовых / В. А. Рыбин. – М.: Колос, 1967. –
216с..8.Паушева, 3. П. Практикум по цитологии растений / З. П. Паушева. М.: Колос, 1980. –304с.9.Каптарь, С. Г. Ускоренный пропионоволакмоидный метод приготовления и окрашивания временных цитологических препаратов для подсчета хромосом у растений / С. Г. Каптарь // Цитология и генетика, 1967. Т. 1, № 4.С. 8790.10.Руденко, И. С. Простой и быстрый метод приготовления временных препаратов для цитологических исследований плодовых / И. С. Руденко, Г. Д. Дудукал // Цитология и генетика, 1972. –Т. 6. – № 3. – С. 266268.11.Седышева, Г. А. К методике окраски соматических хромосом у плодовых растений / Г. А. Седышева // Сорта и технология для современного сада: сб. ст. Тула: Приок. кн. издво, 1990. С. 2427.
Gorbacheva Natalya Gennadievna,Candidate of agricultural sciences, senior scientific worker, GNU VNIISPK Rosselhozacademii, Orel gorbachevanata81@yandex.ru
Sedysheva Galina Alekseevna,Doctor of agricultural sciences, head of cytoembryology laboratory GNU VNIISPK Rosselhozacademii, Orel info@vniispk.ru
Sedov Evgeny Nikolaevich,Doctor of agricultural sciences, academician of RAAS, GNU VNIISPK Rosselhozacademii, Orel info@vniispk.ru
Cytoembryological characteristics of male and female gametophyte formation in two tetraploid apple selections –donors of diploid gametes for breeding on a polyploidy levelAbstract. The cytoembryological characteristics of generative structures of two tetraploid apple selections –donors of diploid gametes are given. In spite of a number of disorders during the meiosis within microsporogenesis, female gametophyte formation in polyploids 253747 (4x) and 304788 (4x), the sufficient quantity of morphologically normal pollen and regular ovules with the developed embryo sacs are formed, which makes them fit for using in apple breeding on a polyploidy level. As carriers of scab immunity genes (Vm, Vf ) they are greatly valuable for the purpose of developing highly resistant and immune triploid apple varieties capable to produce organic fruits. Key words: apple, breeding, polyploidy, donors of diploid gametes, pollen, embryo sac.
gorbachevanata81@yandex.ru
Седышева Галина Алексеевна,доктор сельскохозяйственных наук, зав. лаборатории Цитоэмбриологии, ГНУ «Всероссийский научноисследовательский институт селекции плодовых культур Российской академии сельскохозяйственных наук», г. Орел
info@vniispk.ru
Седов Евгений Николаевич,доктор сельскохозяйственных наук, академик ГНУ «Всероссийский научноисследовательский институт селекции плодовых культур Российской академии сельскохозяйственных наук», г. Орел
info@vniispk.ru
Цитоэмбриологическая характеристика формирования мужского и женского гаметофитов у двух тетраплоидных форм яблони –доноров диплоидных гамет для селекции на полиплоидном уровне
Аннотация.В статье приводится цитоэмбриологическая характеристика генеративных структур двух тетраплоидных форм яблони –доноров диплоидных гамет. Несмотря на ряд нарушений в ходе мейоза при микроспорогенезе, формированииженского гаметофитау полиплоидов 253747 (4х) и 304788 (4х) формируется достаточное количество морфологически нормальной пыльцы и правильных семяпочек с развитыми зародышевыми мешками, что делает их пригодными для использования в селекции яблони на полиплоидном уровне. И как носителигенов иммунитета к парше (Vm, Vf) они представляют большую ценностьдля получениявысокоустоичивых ииммунных триплоидных сортов яблони, способных давать экологически чистую продукцию.Ключевые слова: яблоня, селекция, полиплоидия, доноры диплоидных гамет, пыльца, зародышевый мешок.
Возрастающее действие стрессов среды приводит к неблагоприятной экологической обстановке и, как следствие –к снижению адаптивности сортов плодовых культур. В результате ухудшается товарность и пищевые качества плодов. Это заставляет предъявлятьк новым сортам все возрастающие требования: наряду с высокими показателями качества плодов, они должны обладать устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам среды, соответствовать требованиям интенсивных технологий. Использование в селекции плодовых растений в качестве исходных форм полиплоидов дает возможность увеличить диапазон генетического разнообразия гибридного потомстваи повысить вероятность получения новых форм, отвечающих требованиям интенсивного адаптивного садоводства, тем более после вступления России во Всемирную Торговую Организацию, когда ужесточились условия существования российского товаропроизводителя на рынке садоводческой продукции. Повышение конкурентоспособности возможно за счёт внедрения различных инновационных технологий возделывания плодовоягодных культур, в которых центральная роль отводиться сортименту, пригодности сортов к интенсивному возделыванию. Современные технологии требуют современных сортов. Повышение рентабельности производства ивместе с тем снижение негативного воздействия на экологию –должны стать неотъемлемыми требованиями в современномсадоводстве.Яблоня является одной из важнейших плодовых пород в зоне с умеренным климатом. Несомненный интерес для практического садоводствапредставляют триплоидные сорта яблони, которые обладают комплексом хозяйственноценных признаков: более крупные плоды, более регулярное плодоношение, лучшая товарность и транспортабельность плодов, более высокая самоплодность, устойчивость к болезням, высокое содержание витаминов. Они в значительной степени отвечают возрастающим требованиям рынка[1, 2, 3].
Селекция растений одна из основных составляющих успешного развития производства сельскохозяйственной продукции. Процесс создания новых форм растений базируется на генетическом разнообразии растений и методах его использования селекционерами[4].Получение новых адаптивных триплоидных сортов –важное направление исследований во ВНИИСПК в рамках программы по селекции яблони на полиплоидном уровне. Целенаправленная селекция яблони на полиплоидном уровне –принципиально новый и эффективный метод в селекции. Группой учёных под руководством академика Седова Е.Н. впервые в России и в мире полученаот целенаправленных скрещиванийсерия триплоидных сортов(Масловское, Августа, Дарёна, Бежин луг, Орловский партизан и др.), отличающихся повышенными адаптивными и хозяйственно ценными свойствами[5].Наиболее эффективным методом создания большого гибридного фонда триплоидов яблони является скрещивание разнохромосомных форм типа: диплоид х тетраплоид, тетраплоид х диплоид. Чтобы обеспечить широкий спектр генетического разнообразия триплоидных гибридов необходимо располагать большим набором тетраплоидных форм –доноров диплоидных гамет. Ограниченный набор таких форм является сдерживающимфактором для этого направления селекции. Поэтому выделение новых тетраплоидных форм яблони, изучение цитоэмбриологических особенностей их генеративной сферы, необходимы для рациональной постановки селекционных работ и для прогнозирования результатов этих работ.Объекты и методика исследований.Объектамиисследований послужили две тетраплоидныеформы яблони, содержащие в своем генотипе гены иммунитета к парше.Полученные во ВНИИСПК в отделе селекции яблони.
1. 304788[Либерти × 136106 (сеянец сорта Суворовец)] (4х)
Тетраплоид имеет в своем генотипе ген иммунитета к парше Vf.Плоды у формы 304788 зимнего срока созревания, выше средней массы (180г) (рис. 1).Мякоть плодов зеленоватая, плотная, сочная, кислосладкого вкуса. Химическийсостав плодов: сахара –9,9%, кислота –0,56%, аскорбиновая кислота –6,1мг/100 г. Внешний вид и вкус плодов оцениваются на 4,3 балла.
Рисунок 1
Плодоношение тетраплоидной формы яблони 3047882. 253747 (SR0523 × Антоновка плоская)(4х) –тетраплоидная форма яблони, содержитв своем геноме ген иммунитета Vm(рис. 2).
Рисунок 2
Плоды тетраплоидной формы яблони 253747Цитоэмбриологическая часть работы проводилась в лаборатории цитоэмбриологии ВНИИСПК. Временные препараты для изучения мейоза при микроспорогенезе готовили ацетогематоксилиновым методом [6]. Цветковыепочки фиксировали в уксусном алкоголе (3:1). Фиксация темпоральная на протяжении нескольких дней с момента появления зеленого конуса и до распускания цветка.Постоянные препараты,для изучения женской генеративной сферы, делали в соответствии с общепринятой методикой[7, 8].Срезыизготовляли толщиной 25 мкм. Препараты красили гематоксилином по Гейденгайну.
Для кариологических исследований (плоидность гибридного потомства) применялся пропионоволакмоидный метод [9, 10 11].Прямой подсчет числа хромосом осуществлялся на давленых препаратах из меристем и молодых листочков точек роста.Исследования проводилис использованием микроскопа Nikon50i, Biolar, при увеличении 10 х 1,5 х 40; 10 х 1,5 х 100.Результаты исследований. Так как тетраплоидные формы яблони 304788 и 253747 являются исходным материалом для селекции,важно знать качество формируемых ими гамет.Проследив ход мейоза у этих формследует отметить, что на всех стадияхприсутствуют отклонения от нормы.Процент микроспороцитов саномальными картинами деленияварьирует в зависимости от стадии мейоза и формы.Более правильный ход мейоза утетраплоида 253747(9,134,1%)(рис.3),у формы 304788 процент нарушений выше от 19,9до 51,3% (таблица 1).Абсолютное большинство микроспороцитов с нормальной картиной деления: от 77,5 до 90,9% у формы 253747 и от 48,7 до 80,1%уформы 304788.Таблица 1Характеристика мейоза при микроспорогенезе у тетраплоидных форм яблони
формаСтадия мейоза МетафазаIАнафазаIТелофазаIМетафазаIIАнафазаIIТелофазаIIТетрады% нарушений253747 (4х)17,534,19,122,522,58,710,9304788 (4х)38,744,119,951,332,527,746,4
абв
где
жз
Рисунок 3Нормальный микроспорогенез у тетраплоидной формы яблони253747а–метафазаI; б –анафазаI; в –телофазаI; г –метафазаII; д –анафазаII; е –телофазаII; ж –тетрады; з –пыльца.Отмеченаобщая направленность микроспорогенеза (рис.4). Можно отметить, что у данныхформ количество нарушений от метафазыIвозрастает к анафазеI, в телофазеIснижается, но уже в метафазеIIчисло аномальных микроспороцитов вновь увеличивается, в анафазеIIу формы 304788 постепенно снижается, а у формы 253747 остается на том же уровне. К моменту завершения мейоза, в телофазеIIу обеих форм количество нарушений уменьшается, но на стадии тетрад незначительно увеличивается(рис. 4).
Рисунок 4
Ход мейоза у тетраплоидных форм яблониСпектр разнообразия типов нарушений в ходе микроспорогенеза у формы 304788 более разнообразный (до 9 типов), чем у формы 253747(23 типа). К окончаниюмикроспорогенезаколичество типов нарушений снижается до двух(рис. 5, таблица 2).
Рисунок 5
Количество типов нарушений у тетраплоидных форм яблони
Таблица 2Морфология нарушений в ходе мейоза у тетраплоидных форм яблони Стадия мейозаформа304788 (4х)253747 (4х)МетафазаI–забегание отдельных хромосом или групп хромосом к полюсам веретена деления; –выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;–микроверетено; –диффузное распределение хромосом; –отсутствие хроматина; –забегание отдельных хромосом или групп хромосом к полюсам веретена деления; –выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;
АнафазаI
–отставание отдельных хромосом в центре веретена;–выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;–мост;–сверхчисленные веретена;–отсутствие хроматина; –отставание отдельных хромосом в центре веретена;–мост;
ТелофазаI–микроядра, сверхчисленные ядра–микроядра, сверхчисленные ядра;–мост;МетафазаII–забегание отдельных хромосом или групп хромосом к полюсам веретена деления;–выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;–забегание отдельных хромосом или групп хромосом к полюсам веретена деления;–выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;
–диффузное распределение хромосом; –сверхчисленные веретена; –неравные веретена деления;–асинхронность деления; –дегенерация хроматина;–отсутствие хроматина; –комбинацияиз двух типов нарушений;–комбинация из двух типов нарушений;АнафазаII–отставание отдельных хромосом в центре веретена;–выбросы отдельных хромосом или групп хромосом за пределы ахроматинового веретена;–мост;
–сверхчисленные веретена;
–неравные веретена деления; –комбинация из двух типов нарушений;–отставание отдельных хромосом в центре веретена;–сверхчисленные веретена;–комбинация из двух типов нарушений;ТелофазаII–микроядра, сверхчисленные ядра;
–асинхронность деления;
–дегенерация хроматина;–микроядра, сверхчисленные ядра;–мост;Тетрады–пентада; –гексада;
–гептада.–пентада; –гексада;
При сравнении между собой морфологии нарушений у тетраплоидных форм яблони 304788 и 253747 можно отметить общие для них типы нарушений. Так на стадии метафазаI–это преждевременное забегание отдельных хромосом к полюсам веретена деления(рис. 6а), выброс их за пределы ахроматинового веретена. На стадии анафазаIотставание хромосом в центре веретена деления(рис. 6б), выбросы, мосты(рис. 6в). В телофазеIприсутствие микроядер и сверхчисленных ядер(рис. 6г). У формы 253747 в отдельных микроспороцитах между ядрами сохраняются мостыв виде нитей, сформировавшихся еще на предыдущих стадиях(рис. 6и). Длястадии метафазыIIхарактерно наличие микроспороцитов с забеганиями хромосом(рис. 6д), выбросами(рис. 6е), встречаются комбинации из нескольких типов нарушений в одном микроспороците.На стадии анафазаIIраспространенный тип нарушений –отставание хромосом в центре веретена деления(рис. 6ж), наличие трех, четырех веретен деления, вместо двух (норма).ТелофазаIIхарактеризуется наличием таких аномалий, как микроядра и сверхчисленные ядра(рис. 6з). Вследствиеэтого на стадии тетрад образуются полиадыспорады с большим количеством микроспор: пентады, гексады, гептады(рис. 6к).На стадии тетрад основная масса клеток представлена правильными тетрадами (253747 –89,1%, 304788 –53,6%), распадающимися после созревания на нормальные микроспоры(рис. 3ж).Кроме общих для этих форм нарушений, у формы304788 на разных стадиях отмечены своианомалии:в анафазе IиIIдополнительные веретена делений, сформировавшиеся из групп хромосом, выброшенных в цитоплазму микроспороцита на предыдущих стадиях деления и микроспороциты без хроматина.Вметафазе II
диффузное распределение хромосом, неравные веретена, асинхронность деления, в некоторых микроспороцитах хроматин подвергался дегенерацииили отсутствовал вовсе.
абв
где
жзи
к
л
Рисунок 6
Нарушения в микроспорогенезе у тетраплоидных форм яблониа–метафазаI, забегание хромосом (253747); б –анафазаI, оставание хромосом (304788);в анафазаI, мост (304788); г–телофазаI, микроядро (304788); д–метафазаII, забегание хромосом (304788); е метафазаII, выброс хромосом (253747); ж анафазаII, отставание хромосом (253747); з телофазаII, микроядра (253747); и –телофазаII, мост (253747); к –гексада(304788);
л –пыльца (304788)
К моменту окончания мейоза часть нарушений нивелируется и у тетраплоидов 304788 и 253747 формируется 49,9% и 70% соответственно, морфологически нормальной пыльцы, что позволяет использовать их в селекции в качестве доноров диплоидных гамет.
Скрещиваниятипа 2х х 4х с участием изученных форм, взятых в качестве опылителей, показали высокий выход триплоидных растений в гибридных семьях (таблица –2).
Таблица2Плоидность гибридных сеянцев яблони от разнохромосомных скрещиваний
Гибридная семья (2х х 4х)
Тип скрещиванияКолво изученных сеянцевВтом числедиплоидышт./%триплоидышт./%Антоновка обыкновенная (2х) х 304788 (4х)2х × 4х12049/40,871/59,2Синап Орловский (2х) х 304788(4х)2х × 4х8
8/100Краса Свердловска (2х) х 304788 (4х)2х × 4х7713/16,964/83,12314122 (2х) х 253747(4х)2х × 4х6510/15,455/84,6
Развитие женского гаметофита у тетраплоидных форм яблони 304788 и 253747 идет по одной схеме. Весной происходит формирование семяпочек. В них дифференцируется овальный нуцеллус, одетый внутренними и внешними интегументами. В нуцеллусе закладывается материнская клетка макроспор, из нееразвивается тетрада и формируется зародышевый мешокдвух, четырехи,наконец,восьмиядерный. Эмбриональные структуры зародышевого мешка дифференцируются,и все его элементы приобретают типичное для яблони строение.Изученные формы характеризуются довольно мощным археспориальным комплексом, максимальное число клеток которого достигает 15 –у формы 304788 и 13 –у 253747. Преобладают линейные тетрады макроспор(рис. 7а). Отмечено одновременное развитие двухчетырех дополнительных тетрад(рис. 7б). Объяснить это можно высокой степенью активности женского археспория(рис. 7в). Но при развитии нормального зародышевого мешка активность его затухает. Поэтому только единождыбыло отмечено развитие дополнительного зародышевого мешка.
абв
Рисунок 7
Особенности формирования женского гаметофитаа линейная тетрада, 304788; б дополнительные тетрады, 253747; в две клетки активного археспория, 253747Зрелый зародышевый мешок яйцевидноудлиненной формы, расширенный в микропилярной и зауженный в халазальной части. Клетки яйцевого аппарата грушевидной формы, яйцеклетка содержит крупное ядро. Вблизи яйцевого аппарата находятся полярный ядра. В халазальном конце зародышевого мешка расположены небольшие угловатые клетки –антиподы, которые дегенерируют к моменту созревания зародышевого мешка(рис.8).
абв
Рисунок 8
Дифференцированный восьмиядерный зародышевый мешок, 253747(4х)
а –яйцеклетка; б –синергиды, полярные ядра; в –антиподы.Из аномалий женского гаметофита отмечено: дифференциация всех клеток яйцевого аппаратапо типусинергид(рис. 9а), три клетки антиподы так же могут быть дифференцированы как синергиды. Встречаются многоядерные зародышевые мешки, с количеством ядер от 10 до 18, вместо положенных восьми(рис. 9 б, в). По всей вероятности это связано с расщеплением веретена деления. Дополнительные ядра могут располагаться в разных участках зародышевого мешка, часто эти ядра неправильной формы и разного размера.
абв
Рисунок 9
Аномалииразвития женской генеративной сферыа–
дифференциация клеток яйцевого аппарата по типу синергид (253747); б– пять ядер в микропилярном конце зародышевого(304788); в– пять ядер в халазальномконце зародышевого мешка(304788).Минимальный уровень аномальных зародышевых мешков (21,9%) и семяпочек(2,9%) отмечен у формы 253747. Чуть больше отклонений у формы 304788–это 27,8% аномальных зародышевых мешков и 21,5% аномальных семяпочек (сложные семяпочки, с двумя, тремя нуцеллусами, причем в каждом нуцеллусе развивается свой зародышевый мешок, сидячие семяпочки с недоразвитым фуникулюсом, уродливые мелкие семяпочки с недоразвитыми интегументами)(рис. 10, 11). В некоторых семяпочках происходит дегенерация генеративной ткани.
Рисунок 10
Количество типов нарушений у тетраплоидных форм яблони
абвРисунок 11
Аномалии в развитии семяпочек, 304788 (4х)а –сложная семяпочка с тремя нуцеллусами;
б – сидячая семяпочка с одним интегументом; в –уродливая семяпочка, наружный интегумент растет сам по себе
Тем не менее, несмотря на некоторые отклонения в развитии женского гаметофита, у форм 304788 и 253747 развивается достаточное количество нормальных семяпочек, а на стадии распустившегося цветка присутствуют восьмиядерные зародышевые мешки Polygonumтипа(рис. 12). Следовательно, изученные тетраплоидные формы яблони могут быть привлечены в селекцию на полиплоидном уровне в качестве материнского компонента.
Рисунок 12
Нормальная семяпочка, содержащая восьмиядерный зародышевый мешок , 304788 (4х)Таким образом, проведенные исследованияпо изучениюгенеративной сферы позволяют сделать выводо пригодности использования тетраплоидных форм яблони 304788 и 253747, как доноровдиплоидных гамет в селекции и как опылителей и как материнских исходных формдля получения высокоэффективных, адаптивных триплоидных сортов яблони, отвечающих требованиям современного интенсивного садоводства. А наличие у этих форм генов иммунитета к парше Vf
(304788) и Vm(253747) делает их ценными донорами селекционно значимых признаков, ииспользование ихв селекцииоткрывает большие возможности для создания адаптивных триплоидных сортов, иммунных к парше, способных давать экологически чистуюпродукцию.
Ссылки на источники1.Седов Е. Н. Селекция и сортимент яблони для Центральных регионов России / Е. Н. Седов.Орел: ВНИИСПК, 2005. –312 с.2.Седов Е. Н. Селекция и новые сорта яблони / Е. Н. Седов.Орел: ВНИИСПК, 2011. –624 с.3.Седов, Е. Н. Новые иммунные / Е. Н. Седов, Г. А. Седышева, З. М. Серова // Приусадебное хозяйство. –2005. № 12. –С. 4647.4.Вавилов, Н.И. Теоретические основы селекции. М.: Наука, 1987. 511 с.5.Седов, Е. Н. Селекционная оценка гетероплоидных скрещиваний при создании триплоидных сортов яблони / Е. Н. Седов, Г. А. Седышева, З. М. Серова, Н. Г. Горбачева, С. А. Мельник // Вавиловский журнал генетики и селекции. –2013. №3. –Т 17. –С. 499507.6.Топильская, Л. А. Изучение соматических и мейотичеоких хромосом смородины на ацетогематоксилиновых давленых препаратах / Л. А. Топильска, С. В. Лучникова, Н. П. Чувашина // Бюллетень ЦГЛ им. И. В. Мичурина, 1975. –Вып. 22. –С. 5861.7.Рыбин, В. А. Цитологический метод в селекции плодовых / В. А. Рыбин. – М.: Колос, 1967. –
216с..8.Паушева, 3. П. Практикум по цитологии растений / З. П. Паушева. М.: Колос, 1980. –304с.9.Каптарь, С. Г. Ускоренный пропионоволакмоидный метод приготовления и окрашивания временных цитологических препаратов для подсчета хромосом у растений / С. Г. Каптарь // Цитология и генетика, 1967. Т. 1, № 4.С. 8790.10.Руденко, И. С. Простой и быстрый метод приготовления временных препаратов для цитологических исследований плодовых / И. С. Руденко, Г. Д. Дудукал // Цитология и генетика, 1972. –Т. 6. – № 3. – С. 266268.11.Седышева, Г. А. К методике окраски соматических хромосом у плодовых растений / Г. А. Седышева // Сорта и технология для современного сада: сб. ст. Тула: Приок. кн. издво, 1990. С. 2427.
Gorbacheva Natalya Gennadievna,Candidate of agricultural sciences, senior scientific worker, GNU VNIISPK Rosselhozacademii, Orel gorbachevanata81@yandex.ru
Sedysheva Galina Alekseevna,Doctor of agricultural sciences, head of cytoembryology laboratory GNU VNIISPK Rosselhozacademii, Orel info@vniispk.ru
Sedov Evgeny Nikolaevich,Doctor of agricultural sciences, academician of RAAS, GNU VNIISPK Rosselhozacademii, Orel info@vniispk.ru
Cytoembryological characteristics of male and female gametophyte formation in two tetraploid apple selections –donors of diploid gametes for breeding on a polyploidy levelAbstract. The cytoembryological characteristics of generative structures of two tetraploid apple selections –donors of diploid gametes are given. In spite of a number of disorders during the meiosis within microsporogenesis, female gametophyte formation in polyploids 253747 (4x) and 304788 (4x), the sufficient quantity of morphologically normal pollen and regular ovules with the developed embryo sacs are formed, which makes them fit for using in apple breeding on a polyploidy level. As carriers of scab immunity genes (Vm, Vf ) they are greatly valuable for the purpose of developing highly resistant and immune triploid apple varieties capable to produce organic fruits. Key words: apple, breeding, polyploidy, donors of diploid gametes, pollen, embryo sac.
