Влияние возбудителя дифтерии в составе биоплёнки на функциональную активность и апоптоз макрофагов
Я.
Н. ФроловаБиблиографическое описание статьи для цитирования:
Фролова
Я.
Н. Влияние возбудителя дифтерии в составе биоплёнки на функциональную активность и апоптоз макрофагов // Научно-методический электронный журнал «Концепт». –
2015. – Т. 13. – С.
981–985. – URL:
http://e-koncept.ru/2015/85197.htm.
Аннотация. Объектом исследования послужили типовая и биоплёночная культуры музейного штамма Corynebacterium diphtheriae gravis tox+ № 665, полученного из ГИСК им. Л. А. Тарасевича, и циркулирующего штамма С. diphtheriaе gravis tox+, выделенного от больного. Показано, что способность возбудителя дифтерии формировать биоплёнку ведёт к угнетению функциональной активности макрофагов и индукции их апоптоза, что, по всей видимости, обусловливает длительную персистенцию С. diphtheriaе в организме и предрасполагает к формированию бактерионосительства. Учитывая стимулирующее воздействие НфК на макрофаги (повышение их переваривающей активности и устойчивости к апоптогенному эффекту дифтерийной палочки), заслуживает внимания рассмотрение возможности использования препаратов НфК для коррекции иммунного ответа у бактерионосителей токсигенных штаммов С. diphtheriaе.
Ключевые слова:
фагоцитоз, corynebacterium diphtheriae, типовая и биоплёночная культуры, нейтрофилокины, апоптоз, индекс завершённости фагоцитоза
Текст статьи
ФроловаЯна Николаевна,Ассистент кафедры микробиологии и вирусологии №2, ГБОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет, г.РостовнаДонуyanchikfrolova@yandex.ru
Влияние возбудителя дифтерии в составебиоплёнки на функциональную активность и апоптозмакрофагов
Аннотация.Объектом исследования послужили типовая и биоплёночная культуры музейного штамма Corynebacteriumdiphtheriaegravistox+№665, полученного из ГИСК им. Л. А. Тарасевича, и циркулирующего штамма С. diphtheriaе gravistox+, выделенного от больного. Показано, что способность возбудителя дифтерии формировать биоплёнку ведётк угнетению функциональной активности макрофагов и индукции их апоптоза, что, по всей видимости, обусловливает длительную персистенцию С. diphtheriaе в организме и предрасполагает к формированию бактерионосительства. Учитывая стимулирующее воздействие НфК на макрофаги (повышение их переваривающей активности и устойчивости к апоптогенному эффекту дифтерийной палочки) заслуживает внимания рассмотрение возможности использования препаратов НфК для коррекции иммунного ответа у бактерионосителей токсигенных штаммов С. diphtheriaе.Ключевые слова: Corynebacteriumdiphtheriae,типовая и биоплёночная культуры, нейтрофилокины, апоптоз, фагоцитоз, индекс завершённости фагоцитоза.
ВВЕДЕНИЕВ настоящее время заболеваемость дифтерией в России почти не регистрируется, однако циркуляциявозбудителя среди населения сохраняется благодаря бактерионосительству, представляющему собойсерьёзную проблемуздравоохранения на протяжении многихлет[3,4]. Высокий уровень антитоксического поствакцинального иммунитета не препятствует формированию дифтерийного бактерионосительства, механизмы развития которогодо конца не расшифрованы, несмотря на всестороннее изучение патогенеза и иммунитета при дифтерии.За этиологию и патогенез многих острых и, особенно, хронических бактериальных инфекций ответственны микробные биоплёнки [1,2]. Микроорганизмы в составе биоплёнки приобретают свойства, отличающие их от планктонных культур: они обладают повышенной устойчивостью к воздействию антибиотиков, успешно противостоят фагоцитам, антителам и другим потенциально опасным для них факторам окружающей среды [1,6]. Благодаря существованию в виде микробных сообществбиоплёнок—бактерии, заключённые в матрикс синтезируемых ими полимерных веществ, приобретают способность к длительной персистенции в организме человека [1,6,7]. При такой форме дифтерийной инфекции,как бактерионосительство,возбудитель может находиться в организме в течение нескольких недель или месяцев, проявляя устойчивость к антибактериальной терапии и факторам иммунитета[3,4].ДлительнаяперсистенцияС. diphtheriaев организме можетбыть обусловленаразличными причинами, в том числе, и свойствами самого возбудителя, который,помимо прямого токсического воздействия на организм,способенсохранять жизнеспособность вмакрофагах,вызывая ихапоптоз [9, 11].В этот процесс,помимо токсина,вовлечены и другие факторы патогенности С. diphtheriaе(кордфактор, поверхностные структуры), так как независимо от наличия гена токсигенности коринебактерии способны вызывать апоптоз макрофагов [9,12].Цель исследования —изучениеспособности С. diphtheriaев составе биоплёнкииндуцироватьпроцессы фагоцитозаи апоптозаперитонеальныхмакрофаговмышей invitro.Материалы и методыИсследованы типовая и биоплёночная культуры музейного штамма С. diphtheriaegravistox+№665, полученного из ГИСК им. Л. А. Тарасевича, и циркулирующего штамма С. diphtheriaеgravistox+, выделенного от больного с диагнозом «локализованная форма дифтерии» бактериологической лабораторией ФБГУ «1002 ЦГСЭН СКВО».Типовую культуру музейного и циркулирующего штаммов коринебактерий выращивали на 20% сывороточном агаре в течение 24часов, биоплёночную (недельную) культуру получалипо методике [13]. В работе использованыбеспородные белыемышимассой 1921 г, полученныеиз вивария ФКУЗ «РостовскийнаДону государственный научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора».Для получения нейтрофилокинов (НфК)мышам вводили внутрибрюшинно 2 мл 0,1% раствора гликогена на стерильном забуференном изотоническом растворе натрия хлорида (рН 7,2). Умерщвление животных осуществляли методом цервикальной дислокации после предварительной наркотизации с помощью тиопентала натрия в дозе 5мг/кгчерез 4 часа после введения препарата. Перитонеальный экссудат, содержащий до 90% нейтрофилов (Нф), получали путём вымывания из брюшной полости мышей средой 199(10 мл), содержащей 20% инактивированной (+560С, 30 мин.) сыворотки крупного рогатого скота,5 ед/мл гепаринаи пенициллин (100 ед/мл). В качестве индуктора синтеза нейтрофилокинов использовали клетки С. diphtheriaе gravistox+№665густотой 0,5 ОЕ (500 млн.м.т./мл).Контролем служил 0,15М раствор натрия хлорида. Длительность примирования клеток указанными препаратами составила 4 часа при +370С в атмосфере 5% СО2. После окончания срока инкубации супернатанты получали центрифугированием культуральных жидкостей при 1000 об/мин в течение 10 мин. и изучали регуляторное влияние полученных НфК на фагоцитарную активность макрофагов и их устойчивость к апоптогенному действию типовой и биоплёночной культур исследованных штаммовС. diphtheriaеtox+.Фагоцитарную активность макрофаговопределяли по следующим показателям: фагоцитарное число (ФЧ) —среднее количество поглощённых частиц на 1 клетку; фагоцитарный индекс (ФИ) —процент фагоцитирующих клеток; индекс завершённости фагоцитоза (ИЗФ) —отношение количества колоний в контроле к количеству колоний в опыте. Для постановки реакции фагоцитоза перитонеальный экссудат (0,8 мл) смешивали с микробной взвесью типовой и биоплёночной культуры штаммов C. diphtheriaегустотой 0,5 ОЕ (0,04 мл) и НфК в объёме по 0,04 мл[5]. Для определения ИЗФ проводили высевы из полученных смесей в объёме 0,02 мл на чашки с 20% сывороточным агаром через 15 мин (контроль) и 1,5 часа(опыт). Чашки инкубировали при +370С 24 часа, после чего проводили подсчёт количества выросших колоний и определялиИЗФ.Апоптогенную активность типовой и биоплёночнойкультур музейного и циркулирующего штаммов С. diphtheriaев отношении перитонеальных макрофагов мышей изучали до и после добавления НфК invitroпо характерным морфологическим изменениям в клетках при окрашивании по МайГрюнвальду и докрашиванием по РомановскомуГимзе [9]. Для исследования использовали микробные взвеси культур коринебактерийгустотой 0,5 ОЕ (500 млн.м.т./мл) в разведении1/10, которые соединяли с перитонеальным экссудатом и НфК в равных объёмах.Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов «MicrosoftOffice2007» и «Statistica6.0» для WindowsХР. Достоверность полученных данных оценивали при уровне значимости t≥2 (Р≥95%).Результаты и обсуждениеПри сравнении показателей фагоцитоза макрофагов мышей, индуцированного типовой и биоплёночными культурами исследованных штаммов С.diphtheriaе,никаких отличий при определении поглотительной активности макрофагов (ФЧ, ФИ) не выявлено(табл. 1).Переваривающая активность макрофагов(ИЗФ)в отношении биоплёночной культуры циркулирующего штамма С. diphtheriaе(1,6±0,02%) ниже (t≥2, Р≥95%), чем типовой культуры (2,0±0,09%) этого же штамма.Обработка макрофагов НфК, не оказывая влияния на поглотительную активность макрофагов, способствовала повышению ИЗФ(t≥2, Р≥95%) при исследованиикак типовой, так и биоплёночной культурциркулирующего штамма С. diphtheriaе.Переваривающая активность макрофагов в отношении биоплёночной культуры циркулирующего штамма С. diphtheriaе(2,0±0,05%) оставалось ниже (t≥2, Р≥95%), чемтиповой (2,9±0,3%).Способность индуцировать апоптозперитонеальных макрофагов мышей(табл.2) выраженакак утиповой, так и биоплёночной культурыдвух исследованных штаммов С. diphtheriaе. Количество клеток с признаками апоптозанаходилось в пределах от 55,1±5,3% до 68,3±6,8%. При сравнении апоптогенной активности, индуцированнойтиповой и биоплёночной культурами двух исследованных штаммов С. diphtheriaе,никаких отличий не выявлено.Иные результаты получены при добавлении в среду НфК, под воздействием которых устойчивость перитонеальных макрофаговк апоптогенномувоздействию как типовой, так и биоплёночной культур С. diphtheriaеповышалась. Об этом свидетельствовало значительно меньшее (t≥2, Р≥95%) количество клеток с признакамиапоптоза в присутствииНфК (от 3,5±0,3% до 6,0±0,5%) по сравнению с таковым безНфК(от 55,1±5,3% до 68,3±6,8%). Количество клеток с апоптозом при исследовании биоплёночнойкультуры как музейного (4,0±0,4%), так и циркулирующего (3,5±0,3%) штаммов С. diphtheriaениже (t≥2, Р≥95%), чем типовой культуры этих же штаммов (6,0±0,5% и 5,0±0,6% соответственно).Поглотительная активность макрофагов в отношении как типовой, так и биоплёночной культур коринебактерий одинакова, тогда как переваривающая —менее выражена длябиоплёночной культуры циркулирующего штамма С. diphtheriae. Всоставе клеточной стенкиС. diphtheriaенаходится кордфактор —гликолипид, представляющий собой 6,6'диэфир трегалозы, содержащий коринемиколовую и коринемиколеновую кислоты [10], которыеоказывают ингибирующее воздействие на фагоцитарную активность макрофагов. Это исключает контакт С. diphtheriaeс цитотоксическими компонентами фагоцитов, приводя к незавершённости фагоцитоза. По всей видимости,формированиеэкзополисахаридного матрикса у биоплёночной культуры С. diphtheriaeусугубляет ингибирующее фагоцитоз действие кордфактора.Добавление в реакционную смесь НфК не оказываловлияния на поглотительную способность макрофагов,но усиливалоих переваривающую активность в отношении циркулирующего штамма С. diphtheriaе. Киллинг макрофагамибиоплёночной культурыоставался нижетакового типовой культуры, что свидетельствовалоо меньшей эффективности стимулирующего воздействия НфК на фагоцитоз коринебактерий в составе биоплёнки.Одним из способов защиты бактерий от фагоцитоза является их апоптогенная активность,создающая условия для проникновения бактерий в подлежащие ткани, кровь и внутренние органы[8]. Гибель клеток организма путём апоптоза благоприятна для бактерий, так как при этом не происходит запуска воспалительных реакций. Это создает условия для длительной персистенции возбудителяв организме.С. diphtheriaеобладает выраженной способность к индукции апоптоза макрофагов. ВоздействиеНфК ведётк снижению апоптогенной активности как типовых, таки биоплёночных культур музейного ициркулирующегоштаммов С. diphtheriaе.При исследовании биоплёночных культур коринебактерийданный эффект более выражен.Вероятно, это связано, с тем, чтопомимо прямого стимулирующего воздействия на макрофаги, НфКвступают во взаимодействие и сэкзополисахаридным матриксомбиоплёнок. Этоэкранируетповерхностные структуры бактерий и препятствуетраспространению токсина за пределы биоплёнки.СпособностьС. diphtheriaеформировать биоплёнку ведётк угнетению функциональнойактивностимакрофагови индукции ихапоптоза, что, по всей видимости, обусловливает длительную персистенцию С. diphtheriaев организмеи предрасполагает к формированию бактерионосительства. Учитывая стимулирующее воздействие НфК на макрофаги (повышение их переваривающей активности и устойчивости к апоптогенному эффекту дифтерийной палочки)заслуживает внимания рассмотрение возможности использования препаратов НфК для коррекции иммунного ответа у бактерионосителей токсигенных штаммов С. diphtheriaе.Выводы1.Возбудитель дифтерии в составе биоплёнкиоказываетингибирующее воздействие на функциональнуюактивность макрофагови индуцирует процессы их апоптоза.2.ПрепаратыНфК способствуют повышению переваривающей активности и устойчивости макрофагов к апоптогенному действиюкак типовых, так и биоплёночных культур токсигенных штаммов С.diphtheriae.
Таблица 1Показатели фагоцитоза макрофагов мышей, индуцированного типовой и биоплёночной культурами штаммов С. Diphtheria
ШтаммКультураБез добавления НфКС добавлением НфКФИФЧИЗФФИФЧИЗФС. diphtheriaеgravis tox+ №665 (музейный)типовая20,0±4,00,42±0,21,7±0,0814,0±5,40,63±0,042,1±0,3биоплёночная16,0±5,20,48±0,31,8±0,115,0±5,30,59±0,32,0±0,3С. diphtheriaеgravis tox+ (циркулирующий)типовая16,0±5,20,53±0,32,0±0,09**15,0±5,30,62±0,042,9±0,3*; **биоплёночная17,0±5,10,65±0,041,6±0,02*; **22,0±3,50,79±0,082,0±0,05*; **Условные обозначения:* достоверность различий t≥2 (Р≥95%) между аналогичными показателями фагоцитоза при добавлении НфК и без НфК** достоверность различий t≥2 (Р≥95%) между аналогичными показателями фагоцитоза, индуцированного типовой и биоплёночной культурами каждого штамма
Таблица 2Апоптогенная активность типовой и биоплёночной культур штаммов С. Diphtheriaе
ШтаммКультураПроцент микрофагов с признаками апоптоза (%±m)без НфКс НфКС. diphtheriaеgravis tox+№665 (музейный)типовая55,1±5,36,0±0,5**биоплёночная55,8±5,94,0±0,4*; **С. diphtheriaеgravis tox+(циркулирующий)типовая65,4±6,15,0±0,6*; **биоплёночная68,3±6,83,5±0,3*; **Условные обозначения:* достоверность различий t≥2 (Р≥95%) между количеством клеток с апоптозом при добавленииНфК и без НфК,** достоверность различий t≥2 (Р≥95%) между апоптогенной активностью типовой и биоплёночной культур каждого штамма.
Ссылки на источники1.Белобородова Н. В., Байрамов И. Т.Роль микробных сообществ или биоплёнок в кардиохирургии// Антибиотики и химиотерапия: Ежемесячный научнопрактический журнал. 2008. Т. 53,№ 11/12. С. 4459.2.Гостев В.В., Сидоренко С.В.Бактериальные биоплёнки и инфекции// Журн. инфектол.2012. Т.2,№ 3. С. 45.3.Иванова В.В., Родионова О.В., Корженевская Т.Б.Бактерионосительство токсигенных коринебактерий дифтерии на эпидемическом спаде заболеваемости дифтерией//Рос. мед.журн. 2003. №5. С.3841.4.Костюкова Н.Н., Гукасян Л.А.Патогенез дифтерийного бактерионосительства в иммунологическом аспекте // Журн.гиг.,эпидемиол.,микробиол.иммунол. 1977. Т. 21,№4. С.394398.5.Практикум по иммунологии. Учебное пособие // Под редакцией И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова. М.:МГУ.2001. 224с.6.Романова Ю.М., Диденко Л.В., Толордова Э.Р., Гинцбург А.Л. Биоплёнки патогенных бактерий и их роль в хронизации инфекционного процесса. Поиск средств борьбы с биоплёнками // Вестник РАМН. 2011. № 10. С.3139.7.Смирнова А.Т., Диденко Л.В, Романова Ю.М., АзизбекянР.Р. Структурнофункциональная характеристика бактериальных биоплёнок// Микробиология.2010. Т. 79, №4.С.435446.8.Тюкавкина С.Ю.Роль апоптоза в формировании иммунопатологических процессов, способствующих развитию инфекционных заболеваний// Журн. Иммунология 2013. № 1. С. 5257.9.Харсеева Г.Г., Алутина Э.Л., Васильева Г.И.Апоптоз макрофагов как один из механизмов патогенного действия возбудителя дифтерии// Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2012. №4. С.6366.10.Burkovski A.Cell Envelope of Corynebacteria: Structure and Influence on Pathogenicity // J. Microbiology. 2013.Р. 111.11.Cintina Silva dos Santos, Loisy Sanches dos Santos, Monikca Cristina de Souza. Nonopsoniсphagocytosis of homologous nontoxigenic and Corynebacterium diphtheriaеstair by human U937 macrophages // Microbiol. Immunol. 2010. Vol. 54. P. 110.12.Corynebacterium diphtheriae invasionassociated protein (DIP1281) is involved in cell surface organization, adhesion and internalization in epithelial cells / L. Ott, M. Höller, R. G.Gerlach, M.Hensel, J.Rheinlaender, T. E Schäffer, A.s Burkovski// J. BMC Microbiology.2010.Р.1012.13.Watnick, P.R. Biofilm city of microbes / Watnick P., Kolter R. // J. of Bacteriol. –2000. № 182 (10). Р. 26752679.
Влияние возбудителя дифтерии в составебиоплёнки на функциональную активность и апоптозмакрофагов
Аннотация.Объектом исследования послужили типовая и биоплёночная культуры музейного штамма Corynebacteriumdiphtheriaegravistox+№665, полученного из ГИСК им. Л. А. Тарасевича, и циркулирующего штамма С. diphtheriaе gravistox+, выделенного от больного. Показано, что способность возбудителя дифтерии формировать биоплёнку ведётк угнетению функциональной активности макрофагов и индукции их апоптоза, что, по всей видимости, обусловливает длительную персистенцию С. diphtheriaе в организме и предрасполагает к формированию бактерионосительства. Учитывая стимулирующее воздействие НфК на макрофаги (повышение их переваривающей активности и устойчивости к апоптогенному эффекту дифтерийной палочки) заслуживает внимания рассмотрение возможности использования препаратов НфК для коррекции иммунного ответа у бактерионосителей токсигенных штаммов С. diphtheriaе.Ключевые слова: Corynebacteriumdiphtheriae,типовая и биоплёночная культуры, нейтрофилокины, апоптоз, фагоцитоз, индекс завершённости фагоцитоза.
ВВЕДЕНИЕВ настоящее время заболеваемость дифтерией в России почти не регистрируется, однако циркуляциявозбудителя среди населения сохраняется благодаря бактерионосительству, представляющему собойсерьёзную проблемуздравоохранения на протяжении многихлет[3,4]. Высокий уровень антитоксического поствакцинального иммунитета не препятствует формированию дифтерийного бактерионосительства, механизмы развития которогодо конца не расшифрованы, несмотря на всестороннее изучение патогенеза и иммунитета при дифтерии.За этиологию и патогенез многих острых и, особенно, хронических бактериальных инфекций ответственны микробные биоплёнки [1,2]. Микроорганизмы в составе биоплёнки приобретают свойства, отличающие их от планктонных культур: они обладают повышенной устойчивостью к воздействию антибиотиков, успешно противостоят фагоцитам, антителам и другим потенциально опасным для них факторам окружающей среды [1,6]. Благодаря существованию в виде микробных сообществбиоплёнок—бактерии, заключённые в матрикс синтезируемых ими полимерных веществ, приобретают способность к длительной персистенции в организме человека [1,6,7]. При такой форме дифтерийной инфекции,как бактерионосительство,возбудитель может находиться в организме в течение нескольких недель или месяцев, проявляя устойчивость к антибактериальной терапии и факторам иммунитета[3,4].ДлительнаяперсистенцияС. diphtheriaев организме можетбыть обусловленаразличными причинами, в том числе, и свойствами самого возбудителя, который,помимо прямого токсического воздействия на организм,способенсохранять жизнеспособность вмакрофагах,вызывая ихапоптоз [9, 11].В этот процесс,помимо токсина,вовлечены и другие факторы патогенности С. diphtheriaе(кордфактор, поверхностные структуры), так как независимо от наличия гена токсигенности коринебактерии способны вызывать апоптоз макрофагов [9,12].Цель исследования —изучениеспособности С. diphtheriaев составе биоплёнкииндуцироватьпроцессы фагоцитозаи апоптозаперитонеальныхмакрофаговмышей invitro.Материалы и методыИсследованы типовая и биоплёночная культуры музейного штамма С. diphtheriaegravistox+№665, полученного из ГИСК им. Л. А. Тарасевича, и циркулирующего штамма С. diphtheriaеgravistox+, выделенного от больного с диагнозом «локализованная форма дифтерии» бактериологической лабораторией ФБГУ «1002 ЦГСЭН СКВО».Типовую культуру музейного и циркулирующего штаммов коринебактерий выращивали на 20% сывороточном агаре в течение 24часов, биоплёночную (недельную) культуру получалипо методике [13]. В работе использованыбеспородные белыемышимассой 1921 г, полученныеиз вивария ФКУЗ «РостовскийнаДону государственный научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора».Для получения нейтрофилокинов (НфК)мышам вводили внутрибрюшинно 2 мл 0,1% раствора гликогена на стерильном забуференном изотоническом растворе натрия хлорида (рН 7,2). Умерщвление животных осуществляли методом цервикальной дислокации после предварительной наркотизации с помощью тиопентала натрия в дозе 5мг/кгчерез 4 часа после введения препарата. Перитонеальный экссудат, содержащий до 90% нейтрофилов (Нф), получали путём вымывания из брюшной полости мышей средой 199(10 мл), содержащей 20% инактивированной (+560С, 30 мин.) сыворотки крупного рогатого скота,5 ед/мл гепаринаи пенициллин (100 ед/мл). В качестве индуктора синтеза нейтрофилокинов использовали клетки С. diphtheriaе gravistox+№665густотой 0,5 ОЕ (500 млн.м.т./мл).Контролем служил 0,15М раствор натрия хлорида. Длительность примирования клеток указанными препаратами составила 4 часа при +370С в атмосфере 5% СО2. После окончания срока инкубации супернатанты получали центрифугированием культуральных жидкостей при 1000 об/мин в течение 10 мин. и изучали регуляторное влияние полученных НфК на фагоцитарную активность макрофагов и их устойчивость к апоптогенному действию типовой и биоплёночной культур исследованных штаммовС. diphtheriaеtox+.Фагоцитарную активность макрофаговопределяли по следующим показателям: фагоцитарное число (ФЧ) —среднее количество поглощённых частиц на 1 клетку; фагоцитарный индекс (ФИ) —процент фагоцитирующих клеток; индекс завершённости фагоцитоза (ИЗФ) —отношение количества колоний в контроле к количеству колоний в опыте. Для постановки реакции фагоцитоза перитонеальный экссудат (0,8 мл) смешивали с микробной взвесью типовой и биоплёночной культуры штаммов C. diphtheriaегустотой 0,5 ОЕ (0,04 мл) и НфК в объёме по 0,04 мл[5]. Для определения ИЗФ проводили высевы из полученных смесей в объёме 0,02 мл на чашки с 20% сывороточным агаром через 15 мин (контроль) и 1,5 часа(опыт). Чашки инкубировали при +370С 24 часа, после чего проводили подсчёт количества выросших колоний и определялиИЗФ.Апоптогенную активность типовой и биоплёночнойкультур музейного и циркулирующего штаммов С. diphtheriaев отношении перитонеальных макрофагов мышей изучали до и после добавления НфК invitroпо характерным морфологическим изменениям в клетках при окрашивании по МайГрюнвальду и докрашиванием по РомановскомуГимзе [9]. Для исследования использовали микробные взвеси культур коринебактерийгустотой 0,5 ОЕ (500 млн.м.т./мл) в разведении1/10, которые соединяли с перитонеальным экссудатом и НфК в равных объёмах.Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов «MicrosoftOffice2007» и «Statistica6.0» для WindowsХР. Достоверность полученных данных оценивали при уровне значимости t≥2 (Р≥95%).Результаты и обсуждениеПри сравнении показателей фагоцитоза макрофагов мышей, индуцированного типовой и биоплёночными культурами исследованных штаммов С.diphtheriaе,никаких отличий при определении поглотительной активности макрофагов (ФЧ, ФИ) не выявлено(табл. 1).Переваривающая активность макрофагов(ИЗФ)в отношении биоплёночной культуры циркулирующего штамма С. diphtheriaе(1,6±0,02%) ниже (t≥2, Р≥95%), чем типовой культуры (2,0±0,09%) этого же штамма.Обработка макрофагов НфК, не оказывая влияния на поглотительную активность макрофагов, способствовала повышению ИЗФ(t≥2, Р≥95%) при исследованиикак типовой, так и биоплёночной культурциркулирующего штамма С. diphtheriaе.Переваривающая активность макрофагов в отношении биоплёночной культуры циркулирующего штамма С. diphtheriaе(2,0±0,05%) оставалось ниже (t≥2, Р≥95%), чемтиповой (2,9±0,3%).Способность индуцировать апоптозперитонеальных макрофагов мышей(табл.2) выраженакак утиповой, так и биоплёночной культурыдвух исследованных штаммов С. diphtheriaе. Количество клеток с признаками апоптозанаходилось в пределах от 55,1±5,3% до 68,3±6,8%. При сравнении апоптогенной активности, индуцированнойтиповой и биоплёночной культурами двух исследованных штаммов С. diphtheriaе,никаких отличий не выявлено.Иные результаты получены при добавлении в среду НфК, под воздействием которых устойчивость перитонеальных макрофаговк апоптогенномувоздействию как типовой, так и биоплёночной культур С. diphtheriaеповышалась. Об этом свидетельствовало значительно меньшее (t≥2, Р≥95%) количество клеток с признакамиапоптоза в присутствииНфК (от 3,5±0,3% до 6,0±0,5%) по сравнению с таковым безНфК(от 55,1±5,3% до 68,3±6,8%). Количество клеток с апоптозом при исследовании биоплёночнойкультуры как музейного (4,0±0,4%), так и циркулирующего (3,5±0,3%) штаммов С. diphtheriaениже (t≥2, Р≥95%), чем типовой культуры этих же штаммов (6,0±0,5% и 5,0±0,6% соответственно).Поглотительная активность макрофагов в отношении как типовой, так и биоплёночной культур коринебактерий одинакова, тогда как переваривающая —менее выражена длябиоплёночной культуры циркулирующего штамма С. diphtheriae. Всоставе клеточной стенкиС. diphtheriaенаходится кордфактор —гликолипид, представляющий собой 6,6'диэфир трегалозы, содержащий коринемиколовую и коринемиколеновую кислоты [10], которыеоказывают ингибирующее воздействие на фагоцитарную активность макрофагов. Это исключает контакт С. diphtheriaeс цитотоксическими компонентами фагоцитов, приводя к незавершённости фагоцитоза. По всей видимости,формированиеэкзополисахаридного матрикса у биоплёночной культуры С. diphtheriaeусугубляет ингибирующее фагоцитоз действие кордфактора.Добавление в реакционную смесь НфК не оказываловлияния на поглотительную способность макрофагов,но усиливалоих переваривающую активность в отношении циркулирующего штамма С. diphtheriaе. Киллинг макрофагамибиоплёночной культурыоставался нижетакового типовой культуры, что свидетельствовалоо меньшей эффективности стимулирующего воздействия НфК на фагоцитоз коринебактерий в составе биоплёнки.Одним из способов защиты бактерий от фагоцитоза является их апоптогенная активность,создающая условия для проникновения бактерий в подлежащие ткани, кровь и внутренние органы[8]. Гибель клеток организма путём апоптоза благоприятна для бактерий, так как при этом не происходит запуска воспалительных реакций. Это создает условия для длительной персистенции возбудителяв организме.С. diphtheriaеобладает выраженной способность к индукции апоптоза макрофагов. ВоздействиеНфК ведётк снижению апоптогенной активности как типовых, таки биоплёночных культур музейного ициркулирующегоштаммов С. diphtheriaе.При исследовании биоплёночных культур коринебактерийданный эффект более выражен.Вероятно, это связано, с тем, чтопомимо прямого стимулирующего воздействия на макрофаги, НфКвступают во взаимодействие и сэкзополисахаридным матриксомбиоплёнок. Этоэкранируетповерхностные структуры бактерий и препятствуетраспространению токсина за пределы биоплёнки.СпособностьС. diphtheriaеформировать биоплёнку ведётк угнетению функциональнойактивностимакрофагови индукции ихапоптоза, что, по всей видимости, обусловливает длительную персистенцию С. diphtheriaев организмеи предрасполагает к формированию бактерионосительства. Учитывая стимулирующее воздействие НфК на макрофаги (повышение их переваривающей активности и устойчивости к апоптогенному эффекту дифтерийной палочки)заслуживает внимания рассмотрение возможности использования препаратов НфК для коррекции иммунного ответа у бактерионосителей токсигенных штаммов С. diphtheriaе.Выводы1.Возбудитель дифтерии в составе биоплёнкиоказываетингибирующее воздействие на функциональнуюактивность макрофагови индуцирует процессы их апоптоза.2.ПрепаратыНфК способствуют повышению переваривающей активности и устойчивости макрофагов к апоптогенному действиюкак типовых, так и биоплёночных культур токсигенных штаммов С.diphtheriae.
Таблица 1Показатели фагоцитоза макрофагов мышей, индуцированного типовой и биоплёночной культурами штаммов С. Diphtheria
ШтаммКультураБез добавления НфКС добавлением НфКФИФЧИЗФФИФЧИЗФС. diphtheriaеgravis tox+ №665 (музейный)типовая20,0±4,00,42±0,21,7±0,0814,0±5,40,63±0,042,1±0,3биоплёночная16,0±5,20,48±0,31,8±0,115,0±5,30,59±0,32,0±0,3С. diphtheriaеgravis tox+ (циркулирующий)типовая16,0±5,20,53±0,32,0±0,09**15,0±5,30,62±0,042,9±0,3*; **биоплёночная17,0±5,10,65±0,041,6±0,02*; **22,0±3,50,79±0,082,0±0,05*; **Условные обозначения:* достоверность различий t≥2 (Р≥95%) между аналогичными показателями фагоцитоза при добавлении НфК и без НфК** достоверность различий t≥2 (Р≥95%) между аналогичными показателями фагоцитоза, индуцированного типовой и биоплёночной культурами каждого штамма
Таблица 2Апоптогенная активность типовой и биоплёночной культур штаммов С. Diphtheriaе
ШтаммКультураПроцент микрофагов с признаками апоптоза (%±m)без НфКс НфКС. diphtheriaеgravis tox+№665 (музейный)типовая55,1±5,36,0±0,5**биоплёночная55,8±5,94,0±0,4*; **С. diphtheriaеgravis tox+(циркулирующий)типовая65,4±6,15,0±0,6*; **биоплёночная68,3±6,83,5±0,3*; **Условные обозначения:* достоверность различий t≥2 (Р≥95%) между количеством клеток с апоптозом при добавленииНфК и без НфК,** достоверность различий t≥2 (Р≥95%) между апоптогенной активностью типовой и биоплёночной культур каждого штамма.
Ссылки на источники1.Белобородова Н. В., Байрамов И. Т.Роль микробных сообществ или биоплёнок в кардиохирургии// Антибиотики и химиотерапия: Ежемесячный научнопрактический журнал. 2008. Т. 53,№ 11/12. С. 4459.2.Гостев В.В., Сидоренко С.В.Бактериальные биоплёнки и инфекции// Журн. инфектол.2012. Т.2,№ 3. С. 45.3.Иванова В.В., Родионова О.В., Корженевская Т.Б.Бактерионосительство токсигенных коринебактерий дифтерии на эпидемическом спаде заболеваемости дифтерией//Рос. мед.журн. 2003. №5. С.3841.4.Костюкова Н.Н., Гукасян Л.А.Патогенез дифтерийного бактерионосительства в иммунологическом аспекте // Журн.гиг.,эпидемиол.,микробиол.иммунол. 1977. Т. 21,№4. С.394398.5.Практикум по иммунологии. Учебное пособие // Под редакцией И.А. Кондратьевой, В.Д. Самуилова. М.:МГУ.2001. 224с.6.Романова Ю.М., Диденко Л.В., Толордова Э.Р., Гинцбург А.Л. Биоплёнки патогенных бактерий и их роль в хронизации инфекционного процесса. Поиск средств борьбы с биоплёнками // Вестник РАМН. 2011. № 10. С.3139.7.Смирнова А.Т., Диденко Л.В, Романова Ю.М., АзизбекянР.Р. Структурнофункциональная характеристика бактериальных биоплёнок// Микробиология.2010. Т. 79, №4.С.435446.8.Тюкавкина С.Ю.Роль апоптоза в формировании иммунопатологических процессов, способствующих развитию инфекционных заболеваний// Журн. Иммунология 2013. № 1. С. 5257.9.Харсеева Г.Г., Алутина Э.Л., Васильева Г.И.Апоптоз макрофагов как один из механизмов патогенного действия возбудителя дифтерии// Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2012. №4. С.6366.10.Burkovski A.Cell Envelope of Corynebacteria: Structure and Influence on Pathogenicity // J. Microbiology. 2013.Р. 111.11.Cintina Silva dos Santos, Loisy Sanches dos Santos, Monikca Cristina de Souza. Nonopsoniсphagocytosis of homologous nontoxigenic and Corynebacterium diphtheriaеstair by human U937 macrophages // Microbiol. Immunol. 2010. Vol. 54. P. 110.12.Corynebacterium diphtheriae invasionassociated protein (DIP1281) is involved in cell surface organization, adhesion and internalization in epithelial cells / L. Ott, M. Höller, R. G.Gerlach, M.Hensel, J.Rheinlaender, T. E Schäffer, A.s Burkovski// J. BMC Microbiology.2010.Р.1012.13.Watnick, P.R. Biofilm city of microbes / Watnick P., Kolter R. // J. of Bacteriol. –2000. № 182 (10). Р. 26752679.
