Сравнительный анализ оценки экспрессии гена PCNA с использованием различных методик
ART 54309
УДК
001
В.
В. СавгачевБиблиографическое описание статьи для цитирования:
Савгачев
В.
В.,
Морозова
Н.
А.,
Шубин
Л.
Б.,
Всемирнов
К.
О.,
Горбачев
Ю.
В.,
Горбачева
Д.
С. Сравнительный анализ оценки экспрессии гена PCNA с использованием различных методик // Научно-методический электронный журнал «Концепт». –
2014. – Т. 20. – С.
246–250. – URL:
http://e-koncept.ru/2014/54309.htm.
Аннотация. Рассматривается вариант решения проблемы, возникающей при выборе критериев для построения прогностических оценок судьбы онкобольных. Изучены 256 случаев рака толстой кишки. Весь материал был взят из прозектур г. Ярославля и Ярославской области за период с 2005 по 2012 год. Каждый случай был представлен препаратом, окрашенным антисывороткой, меченой пероксидазой хрена (PCNA). Произведен сравнительный анализ трех способов оценки экспрессии гена PCNA методом ROC-анализа. Найден оптимальный из имеющихся программно-аппаратный способ.
Текст статьи
Шубин Леонид Борисович,кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической анатомии с курсом судебной медицины,Институт последипломного образованияГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ярославльlbsh@yandex.ru
Савгачев Виталий Владимирович,клинический ординатор,Институт последипломного образования ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации,г.Ярославльhirurg2288@mail.ru
Всемирнов Кирилл Олегович,студент,лечебныйфакультет,ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ярославльlbsh@yandex.ru
Морозова Наталия Александровна,студентка,лечебный факультет, ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ярославльmoronya1992@mail.ru
Горбачев Юрий Валерьевич,студент, лечебный факультет, ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, гЯрославльsab_anshtane@mail.ru
Горбачева Дарья Сергеевна,студентка,лечебный факультет, ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
г Ярославльparadigma91@mail.ru
Сравнительный анализ оценки экспрессии гена PCNA
с использованием различных методик
Аннотация.Рассматривается вариант решения проблемы, возникающей при выборе критериев для построения прогностических оценок судьбы онкобольных. Изучены 256 случаев рака толстой кишки. Весь материал был выкопирован из прозектур г. Ярославля и Ярославской области за период с 2005 по 2012 год. Каждый случай был представлен препаратом, окрашенным антисывороткой, меченой пероксидазой хрена (PCNA). Произведен сравнительный анализ трех способов оценки экспрессии гена PCNAметодом ROCанализа. Найден оптимальный из имеющихсяпрограммноаппаратный способ.Ключевые слова:рак, пролиферация, PCNA, выживаемость, прогноз.
Впоследнее времястандартом defactoв морфологическомисследованиисталоиспользование иммуногистохимическихметодов, в частности применение антител к ядернымбелкам, которые позволяют определить интенсивность темпов клеточного роста[1].К ним относятся исследование антигена ядер клеток,готовящихся к делению (ProliferatingCellNuclearAntigen) –PCNA, максимально экспрессирующегося в Sфазе и соответственно отражающего пул пролиферирующих клеток, активность которых является одним из ключевых механизмов, определяющих как злокачественную трансформацию клеток, так и биологическое поведение уже возникших опухолей[2, 3].Это можно использовать для оценки прогнозатечения заболевания[4, 5].Методы оценки экспрессии гена PCNAне лишеныбольшой долисубъективизма. Сейчасв практике используется метод полуколичественной оценки пролиферативной активности[6, 7]. Как альтернатива ему используется методика гистосчета (Histochemical score)[8].Мы же предлагаем свойпрограммноаппаратныйметодоценки экспрессии гена PCNA.Цель
Целью нашей работы является создание объективной, точной и простой в использовании методики оценки экспрессии гена PCNA, а также выявление возможностииспользования количественно выраженного представления экспрессии данного гена в построении прогностических моделей.В связи с чем были построены следующие задачи:1.Оценить экспрессию гена PCNAпо полуколичественнойметодике.2.Оценить экспрессию гена PCNAметодом количественной оценки(Histochemical score).3.Оценить экспрессию гена PCNAоригинальным программноаппаратным методом.4.Выявить наиболее информативную, объективную и прогностически ценную методику.Материалы и методыНами исследовано 256случаев ракатолстой кишки. Весьматериалбылвыкопирован из прозектур г. Ярославля и Ярославской областиза период с 2005 по 2012 годы. Каждый случай был представлен препаратом, окрашенным антисывороткой, меченой пероксидазой хрена (PCNA).Иммуногистохимическое исследование проводили на биопсийномматериале на депарафинированных срезах толщиной 45 мкм, расположенных на предметных стеклах. Использовались моноклональные антитела к ядерному белку пролиферирующих клеток (PСNA) (DAKO RealTMEnVisionTMDetectionSistemsPeroxidase/DAB, Rabbit/Mouse). Во всех случаях проводили докрашивание ядер гематоксилином.Следующим этапом исследования стало изучение пролиферативной активности ткани. Для чего препараты, окрашенные иммуногистохимическим методом, изучались с помощью трех методик: полуколичественной, метод Histochemical score и с помощью программноаппаратного комплекса.Полуколичественная методика представляла собой оценку выраженности пролиферативной активности с использованием световой микроскопии. Подсчет производился в зоне максимального неблагополучия в одном поле зрения при увеличении х200. В случае окраски всех ядер темнокоричневым цветом интенсивность окраски принималась как 100%ая. При отсутствии окраски интенсивность была нулевой[9, 10]. Исходя из этого, была принята следующая шкала:1.Если доля темноокрашенных ядер превышала 3 четверти всех ядер, то интенсивность окраски обозначалась как выраженная (более 75%)(рис.1);
Рис.1.Выраженная интенсивность окраски
2.В случае, когда доля ярко окрашенных ядер не превышала 3 четвертей всех ядер, то интенсивность была умеренно положительной (2575%)(рис.2);
Рис.2.Умеренновыраженная интенсивность окраски
3.Если доля ядер темнокоричневого цвета не превышала 1 четверти всех ядер, то интенсивность была слабо положительной (024%) (рис.3).
Рис.3.Слабовыраженная интенсивность окраски
Для количественной оценки экспрессии маркера мы использовали разработанную Mc. Carthy и соавторами систему подсчета Histochemical score(H.S.). Данный метод включает интенсивность иммуноцитохимической окраски, оцениваемую по 5ти балльной шкале, и долю окрашенных клеток. Гистосчет представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски набалл, соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски в баллах распределялась так: 0 –нет окрашивания, 1 –слабое окрашивание, 2 –умеренное окрашивание, 3 –сильное, 4 –очень сильное окрашивание. Таким образом, максимальное количество Histochemical score не может превышать 400[8, 11]. Формула подсчета:Histochemical score = ∑ P(i)×i(гистосчет),где i –интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 –4,Р(i) –процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.Подсчет проводился в трех когортах по 100 опухолевых клеток в различных полях зрения (х 400).Третья методика –программноаппаратная оценка.Первоначально с помощью программноаппаратного комплекса (световой микроскоп МБИ11, зеркальный цифровой фотоаппарат CanonEOS1100D, системой удаленного управления и оцифровки изображения PSRemote версия 1.9.1) производилась оцифровка видимого в оптический микроскоп изображения на ПК[12]. Для объективизации оценки экспрессии PCNA в опухолевых клетках использовали программуImageJ(NationalInstitutesofHealth, USA) версия 1.48o, 2013 год(рис. 4,5)[13].
Рис. 4.Исходное изображение
Рис.5.Объективизированное изображение
Интенсивность экспрессии маркера PCNA анализировали по гистограммам, представляющим графическое распределение частот включения метки PCNA на поверхности среза ткани. На горизонтальной оси гистограммы откладывали значения градаций яркости по шкале серого цвета от 0 (черный) до 255 (белый)(рис. 68)[12, 14].
Рис.6.Гистограмма интенсивности экспрессии 1
Рис.7.Гистограмма интенсивности экспрессии 2
Рис.8.Гистограмма интенсивности экспрессии 3
Для снятия интересующих параметров производилась первичная обработка изображения, исключающая погрешность, возникающую при анализе не ядерных элементов ткани. Это достигалось процедурой автоматической интерактивной фильтрации области интереса, используя в качестве критериев фильтр «IsoDate» по шкалам RGBс покрытием области, не несущей необходимой информации белым цветом[10, 13]. На следующем этапе проводилось построение гистограммы распределения серых значений области,прошедшей фильтр, и учетом данных среднего значения распределения, при этом увеличение значения соответствовало снижению уровня экспрессии маркера. Впоследствии, для удобства статистической обработки полученных данных использовали инвертированное среднее значение распределения построенной гистограммы области,прошедшей фильтр[12, 13].Статистическую обработку полученных данных произвели с помощью программы STATISTICA(dataanalysissoftwaresystem) StatSoft, Inc., 2011 версии 10.0 и MedCalc12.6.1.0. (MedCalcSoftwarebvba) в среде WINDOWS.Применены процедуры описательных статистик, методы ROCанализа[15, 16, 17].Результатыи обсуждениеУчитывая характер снимаемой информации данные имели определенную степень неоднородности, а именно, были представлены как качественными, так и количественными значениями. Для качественных данных использовалась процедура учета абсолютных и относительных частот[15]. Результаты этого оценивания снятой информации методом полуколичественной оценки представлены в таблице 1 и на рисунке 9.Таблица 1 Описание полуколичественной оценки
Интенсивность окраскиАбсолютнаячастотаОтносительнаячастотаСлабо положительная187,03%Умеренно положительная3814,84%Выраженная20078,13%
Рис. 9.Описание данных метода полуколичественной оценки
Следует отметить что при этом методе оценки выраженности экспрессии гена PCNAпрактически все случаи (78,13%) были верифицированы как выраженная степень экспрессии[18].Далее оценилипрогностическуюсостоятельностьметода полуколичественной оценки с помощью анализа характеристических кривых[16, 17]. Визуальное оценивание полученной ROCкривой (рис. 10)наводит на мысль о низкой характерологической способности критерия.Это подтверждают дальнейшие вычисления (табл. 2).Таблица 2Анализ характеристической кривой метода полуколичественной оценки
ПеременнаяПолуколичественная оценкаКлассифицирующая переменнаяВыживаемостьПлощадь под кривой
0,53Стандартная ошибка
0,1295% доверительный интервалот0,329до 0,722Уровень значимостиP(Площадь=0.5)0,81КритерийЧувствительность95%доверительный интервалСпецифичность95%Доверительный интервал+LRLR102*25,00от7,4до 52,481,82от48,2до 97,21,380,92
+LR:
Положительное отношение правдоподобияLR:
Отрицательное отношение правдоподобия
Рис.10.Характеристическая кривая полуколичественной оценки PCNA
Так площадь под кривой имела значение 0,53, что практически не дает ей возможность «оторваться» от бесполезного классификатора.На следующем этапе были описаны количественные данные, полученные с использованиемметодики Histochemicalscore.Результаты представлены в таблице 3.Таблица 3Описательная статистика данных методики Histochemicalscore
ПеременнаяКоличество исследованийСреднее значениеДоверительный интервал95,000%Доверительный интервал95,000%МинимумМаксимумСтд. ОтклонениеСтд. ошибкаHistochemicalscore256212,52193,22231,8250,00278,0048,799,39
После чего,аналогичным образомпроизвели оценку вариационного ряда на возможность бинарного деления процедурой ROCанализа.При визуальной оценке (рис. 11)построенной ROCкривойследует отметить факт выпадения части этой кривой ниже линии разделения, что не могло не сказаться на дальнейшей процедуре проводимого анализа.Его результаты представлены в таблице 4. Следует отметить, что площадь под кривой имела такое же (0,53) не высокое значение.Таблица 4Анализ характеристической кривой метода Histochemical score
ПеременнаяHistochemical scoreКлассифицирующая переменнаяВыживаемостьПлощадь под кривой
0,53Стандартная ошибка
0,1195%доверительный интервал
от0,334до 0,727Уровень значимостиP(Площадь=0.5)0,77КритерийЧувствительность95%Доверительный интервалСпецифичность95%Доверительный интервал+LRLR�197*68,7541,4
88,954,5523,5
83,11,510,57+LR:
Положительное отношение правдоподобияLR:
Отрицательное отношение правдоподобия
Рис.11.Характеристическая кривая оценки PCNAметодикой Histochemical score
Аналогичным образом были описаны данные, снятыеметодом программноаппаратной оценки.Ее результаты представлены в таблице 5.Таблица 5
Описание информации, снятой методом программноаппаратной оценки
ПеременнаяКоличество исследованийСреднее значениеДоверительный интервал95,000%Доверительный интервал95,000%МинимумМаксимумСтд. ОтклонениеСтд. ошибкаПрограммноаппаратная оценка256106,64101,08112,1965,77153,7722,232,78
Итак жепровели оценку характеристической кривой данной методики (рис. 12и табл. 6).
Таблица 6
Анализ характеристической кривой метода программноаппаратной оценки
ПеременнаяПрограммноаппаратная оценкаКлассифицирующая переменнаяВыживаемостьПлощадь под кривой
0,65Стандартная ошибка
0,1095%Доверительный интервал
от0,453 до 0,817Уровень значимостиP(Площадь=0.5)0,14КритерийЧувствительность95%Доверительный интервалСпецифичность95%Доверительный интервал+LRLR�83,385*61,11от 35,8 до 82,672,73от 39,1до 93,72,240,53+LR:
Положительное отношение правдоподобияLR:
Отрицательное отношение правдоподобия
Рис.12. Характеристическая кривая программноаппаратной оценки
Проводить какоелибо прямое сравнение методов учета выраженности экспрессии смыслане имеет, по причине разного калибра используемых шкал. Вместе с тем ROCанализ позволяет оценить значимостьразличий и преимущество того или иного метода оценивания[17]. Процедурой оценивания всех трех характеристических кривых выявлено преимущество программноаппаратной методики перед двумя другими[19]. Графически это представлено на рисунке 13.В таблице 7 приведены сводные данные по площадям трех методик с указанием 95% доверительных интервалов.Таблица 7
Анализ характеристических кривых методов оценки PCNAПеременная1Histochemical scoreПеременная2Полуколичественная оценкаПеременная3Программноаппаратная оценкаКлассифицирующая переменнаяВыживаемость
ПеременныеПлощадь под кривойСтандартная ошибка95%Доверительный интервалГистосчет0,530,11от 0,334 до 0,727Полуколичественная оценка0,530,12от 0,329до 0,722Программноаппаратная оценка0,610,11от 0,403до 0,788
Рис.13.Анализ характеристических кривых методов оценки PCNA
При ближайшем рассмотрении трёх методик оценки PCNAв виде результатов процедуры анализа характеристических кривых с вычислением площади под ними выявили, что максимальная площадь под кривой принадлежит методике программноаппаратной оценки пролиферативнойактивности (см. рис. 1013, табл. 2,4,6,7). Таким образом, использование методики программноаппаратной оценки экспрессии маркеравидится наиболее перспективным для построения прогнозов[5, 9, 20]. Так же разработанная методика программноаппаратной оценки оказалась наиболее быстрой и лёгкойв использовании.ВыводыВ процессе постановки диагноза, равно как и построения прогнозов, данные лабораторных исследований в большинстве случаев играют лишь вспомогательную роль, и, несмотря на появление новых современных методов клинического обследования онкологических больных, и сейчас ни у кого не вызывает сомнения то обстоятельство, что лишь детальная морфологическая характеристика новообразования может дать возможность клиницисту обоснованно, а главное адресно выбрать тактику лечения конкретного онкобольного[21]. В связи с чемразработанная методика программноаппаратной оценки количественно выраженного представления экспрессииPCNAявляется более объективной, точной и простой в использовании, а такженаиболее значимой в построении прогнозов, чем остальные. Данный показатель можно успешно использовать в создании прогностических моделей лишь совместно с дополнительными предикторами.
Ссылки на источники1.Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека [Текст]: Руководство для врачей /Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. ‒ 4е изд., доп. иперераб.–Казань, 2013. –624с.2.Naryzhny S.N. Role of PCNA Interactions in cancer: proteomics view [Текст] /S.N. Naryzhny, H Lee //Materials of the HUPO 8thAnnual World Congress, Toronto, Canada, 2009 –Clinical Proteomics. –2009. V.5. S1. –72p.3.Shi M. A networkbased gene expression signature informs prognosis and treatment for colorectal cancer patients [Текст] /M. Shi,R.D. Beauchamp, B. Zhang //PLoS One. –2012. –7(7). –e41292.4.Vasile L. Prognosis of colorectal cancer: clinical, pathological and therapeutic correlation [Текст] /L. Vasile, A. Olaru, M. Munteanu et all //Rom J Morphol Embryol. –2012. –53(2). –383391p.5.SanzPamplona R. Clinical value of prognosis gene expression signatures in colorectal cancer: a systematic review [Текст] /R. SanzPamplona, A. Berenguer, D. Cordero et all //PLoS One. –2012. –7(11). –e488776.Нарыжный С.Н. К вопросу об онкомаркерах: о чем нам может рассказать PCNA? [Текст] //Медикогенетические проблемы онкологических заболеваний: сб. материалов Всерос. науч. конф., Стерлитамак, 1718 нояб. 2010 г. /Креативная Хирургия и Онкология. 2010. №.4 (Приложение). C.43.7.Naryzhny S.N. Proliferating cell nuclear antigen in the cytoplasm interacts with components of glycolysis and cancer [Текст] /S.N. Naryzhny, H. Lee //FEBS Lett. –2010 Oct. –584(20). –42924298p.8.Legolvan M.P. Application of molecular techniques in the diagnosis, prognosis andmanagement of patients with colorectal cancer: a practical approach[Текст] /M.P. Legolvan, R.J. Taliano, M.B. Resnick //Hum Pathol. –2012 Aug. –43(8). –11571168p.9.Kovac D. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) as a prognostic factor for colorectal cancer [Текст] /D. Kovac, M. Rubinic, M. Krasevic et all //Anticancer Res. –1995 SepOct. –15(5B). –23012302 p.10.Qasim B.J.Immunohistochemical expression ofPCNAand CD34 incolorectaladenomas and carcinomas using specified automated cellular image analysis system: a clinicopathologic study[Текст] /B.J. Qasim, H.H. Ali, A.G. Hussein et all//Gastroenterol. –2012 JulAug. –18(4). –268276p.11.Панченко К.И. Учет морфологических особенностей эпителиев в прогнозировании выживаемости больных раком различных локализаций [Текст] /К.И. Панченко, Л.Б. Шубин, В.А. Макарова и др. //Морфология (архив анатом. гистол. эмбриол). –2010. –Т. 137, вып. 4. –С. 225.12.Dougherty G.Digital Image Processing for Medical Applications[Текст] /G. Dougherty//Cambridge University Press,2009. –462p.13.Girish V.Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ[Текст] /V. Girish, A. Vijayalakshmi //Indian J Cancer –2004. –41(1). –47p.14.Collins T.J. ImageJ for microscopy [Текст] /T.J. Collins//BioTechniques.–2007 Jul. –43(1). –2530p.15.Боровиков В.П. STATISTICA. Искусство анализа данных на компьютере /В.П. Боровиков. –СПб: Питер, 2003. –688с.16.Armitage P. Statistical methods in medical research [Текст] /P. Armitage, G. Berry, J.N.S. Matthews –4th ed. Blackwell Science, 2002. –610p.17.Zweig M.H. Receiveroperating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine [Текст] /M.H. Zweig, G. Campbell //Clin. Chem. –1993 Apr. –39(4). –561577p.18.Akagi Y. Prognostic impact of lymphatic invasion of colorectal cancer: a singlecenter analysis of 1,616 patients over 24 years [Текст] /Y. Akagi, Y. Adachi, T. Ohchi et all //Anticancer Res. –2013 Jul. –33(7). –29652970p.19.Fred C. Pampel Logistic Regression: A Primer. [Текст] /Pampel, Fred C. –1 ed. SAGE Publications, Inc, 2000. –96p.20.Goéré D. Incidence and prognosis of synchronous colorectal carcinomatosis [Текст] /D. Goéré, M.A. Allard, C. Honoré et all //Future Oncol. –2013 Apr. –9(4). –541549p.21.Состояние онкологической помощи населению России в 2011 году [Текст] /Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой //Москва: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России. –2012. –240с.
Leonid Shubin,
сandidateof Medical Sciences, Associate Professor, Department of Pathological Anatomy with Forensic Medicine course and Institute of Postgraduate Education YarSMA, Yaroslavllbsh@yandex.ruVitaly Savgachev,
Clinical intern, Institute of Postgraduate Education YarSMA, Yaroslavlhirurg2288@mail.ruKirill Vsemirnov,
6 year medical student faculty YarSMA, Yaroslavllbsh@yandex.ruNatalia Morozova,
5th year student of medical faculty YarSMA, Yaroslavlmoronya1992@mail.ruYurii Gorbachev,
6 year medical student faculty YarSMA, Yaroslavlsab_anshtane@mail.ruDaria Gorbacheva,
6 year medical student faculty Yagma, Yaroslavlparadigma91@mail.ruComparative analysis of gene expression evaluation PCNA using various techniquesAbstract.The solution to the problem that arises with regard to criteria for building prognostic assessments fate of cancer patients. Studied 256 cases of colon cancer. All material was withdrawnprosectorium of Yaroslavl and Yaroslavl region for the period 2005 to 2012. Each case was submitted preparations stained with antisera labeled with horseradish peroxidase (PCNA). A comparative analysis of the three ways to assess gene expression PCNA by ROCanalysis. The optimal of existing software and hardware method.Keywords:cancer, proliferation, PCNA, survival prognosis.
Савгачев Виталий Владимирович,клинический ординатор,Институт последипломного образования ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации,г.Ярославльhirurg2288@mail.ru
Всемирнов Кирилл Олегович,студент,лечебныйфакультет,ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ярославльlbsh@yandex.ru
Морозова Наталия Александровна,студентка,лечебный факультет, ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ярославльmoronya1992@mail.ru
Горбачев Юрий Валерьевич,студент, лечебный факультет, ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, гЯрославльsab_anshtane@mail.ru
Горбачева Дарья Сергеевна,студентка,лечебный факультет, ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
г Ярославльparadigma91@mail.ru
Сравнительный анализ оценки экспрессии гена PCNA
с использованием различных методик
Аннотация.Рассматривается вариант решения проблемы, возникающей при выборе критериев для построения прогностических оценок судьбы онкобольных. Изучены 256 случаев рака толстой кишки. Весь материал был выкопирован из прозектур г. Ярославля и Ярославской области за период с 2005 по 2012 год. Каждый случай был представлен препаратом, окрашенным антисывороткой, меченой пероксидазой хрена (PCNA). Произведен сравнительный анализ трех способов оценки экспрессии гена PCNAметодом ROCанализа. Найден оптимальный из имеющихсяпрограммноаппаратный способ.Ключевые слова:рак, пролиферация, PCNA, выживаемость, прогноз.
Впоследнее времястандартом defactoв морфологическомисследованиисталоиспользование иммуногистохимическихметодов, в частности применение антител к ядернымбелкам, которые позволяют определить интенсивность темпов клеточного роста[1].К ним относятся исследование антигена ядер клеток,готовящихся к делению (ProliferatingCellNuclearAntigen) –PCNA, максимально экспрессирующегося в Sфазе и соответственно отражающего пул пролиферирующих клеток, активность которых является одним из ключевых механизмов, определяющих как злокачественную трансформацию клеток, так и биологическое поведение уже возникших опухолей[2, 3].Это можно использовать для оценки прогнозатечения заболевания[4, 5].Методы оценки экспрессии гена PCNAне лишеныбольшой долисубъективизма. Сейчасв практике используется метод полуколичественной оценки пролиферативной активности[6, 7]. Как альтернатива ему используется методика гистосчета (Histochemical score)[8].Мы же предлагаем свойпрограммноаппаратныйметодоценки экспрессии гена PCNA.Цель
Целью нашей работы является создание объективной, точной и простой в использовании методики оценки экспрессии гена PCNA, а также выявление возможностииспользования количественно выраженного представления экспрессии данного гена в построении прогностических моделей.В связи с чем были построены следующие задачи:1.Оценить экспрессию гена PCNAпо полуколичественнойметодике.2.Оценить экспрессию гена PCNAметодом количественной оценки(Histochemical score).3.Оценить экспрессию гена PCNAоригинальным программноаппаратным методом.4.Выявить наиболее информативную, объективную и прогностически ценную методику.Материалы и методыНами исследовано 256случаев ракатолстой кишки. Весьматериалбылвыкопирован из прозектур г. Ярославля и Ярославской областиза период с 2005 по 2012 годы. Каждый случай был представлен препаратом, окрашенным антисывороткой, меченой пероксидазой хрена (PCNA).Иммуногистохимическое исследование проводили на биопсийномматериале на депарафинированных срезах толщиной 45 мкм, расположенных на предметных стеклах. Использовались моноклональные антитела к ядерному белку пролиферирующих клеток (PСNA) (DAKO RealTMEnVisionTMDetectionSistemsPeroxidase/DAB, Rabbit/Mouse). Во всех случаях проводили докрашивание ядер гематоксилином.Следующим этапом исследования стало изучение пролиферативной активности ткани. Для чего препараты, окрашенные иммуногистохимическим методом, изучались с помощью трех методик: полуколичественной, метод Histochemical score и с помощью программноаппаратного комплекса.Полуколичественная методика представляла собой оценку выраженности пролиферативной активности с использованием световой микроскопии. Подсчет производился в зоне максимального неблагополучия в одном поле зрения при увеличении х200. В случае окраски всех ядер темнокоричневым цветом интенсивность окраски принималась как 100%ая. При отсутствии окраски интенсивность была нулевой[9, 10]. Исходя из этого, была принята следующая шкала:1.Если доля темноокрашенных ядер превышала 3 четверти всех ядер, то интенсивность окраски обозначалась как выраженная (более 75%)(рис.1);
Рис.1.Выраженная интенсивность окраски
2.В случае, когда доля ярко окрашенных ядер не превышала 3 четвертей всех ядер, то интенсивность была умеренно положительной (2575%)(рис.2);
Рис.2.Умеренновыраженная интенсивность окраски
3.Если доля ядер темнокоричневого цвета не превышала 1 четверти всех ядер, то интенсивность была слабо положительной (024%) (рис.3).
Рис.3.Слабовыраженная интенсивность окраски
Для количественной оценки экспрессии маркера мы использовали разработанную Mc. Carthy и соавторами систему подсчета Histochemical score(H.S.). Данный метод включает интенсивность иммуноцитохимической окраски, оцениваемую по 5ти балльной шкале, и долю окрашенных клеток. Гистосчет представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски набалл, соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски в баллах распределялась так: 0 –нет окрашивания, 1 –слабое окрашивание, 2 –умеренное окрашивание, 3 –сильное, 4 –очень сильное окрашивание. Таким образом, максимальное количество Histochemical score не может превышать 400[8, 11]. Формула подсчета:Histochemical score = ∑ P(i)×i(гистосчет),где i –интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 –4,Р(i) –процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.Подсчет проводился в трех когортах по 100 опухолевых клеток в различных полях зрения (х 400).Третья методика –программноаппаратная оценка.Первоначально с помощью программноаппаратного комплекса (световой микроскоп МБИ11, зеркальный цифровой фотоаппарат CanonEOS1100D, системой удаленного управления и оцифровки изображения PSRemote версия 1.9.1) производилась оцифровка видимого в оптический микроскоп изображения на ПК[12]. Для объективизации оценки экспрессии PCNA в опухолевых клетках использовали программуImageJ(NationalInstitutesofHealth, USA) версия 1.48o, 2013 год(рис. 4,5)[13].
Рис. 4.Исходное изображение
Рис.5.Объективизированное изображение
Интенсивность экспрессии маркера PCNA анализировали по гистограммам, представляющим графическое распределение частот включения метки PCNA на поверхности среза ткани. На горизонтальной оси гистограммы откладывали значения градаций яркости по шкале серого цвета от 0 (черный) до 255 (белый)(рис. 68)[12, 14].
Рис.6.Гистограмма интенсивности экспрессии 1
Рис.7.Гистограмма интенсивности экспрессии 2
Рис.8.Гистограмма интенсивности экспрессии 3
Для снятия интересующих параметров производилась первичная обработка изображения, исключающая погрешность, возникающую при анализе не ядерных элементов ткани. Это достигалось процедурой автоматической интерактивной фильтрации области интереса, используя в качестве критериев фильтр «IsoDate» по шкалам RGBс покрытием области, не несущей необходимой информации белым цветом[10, 13]. На следующем этапе проводилось построение гистограммы распределения серых значений области,прошедшей фильтр, и учетом данных среднего значения распределения, при этом увеличение значения соответствовало снижению уровня экспрессии маркера. Впоследствии, для удобства статистической обработки полученных данных использовали инвертированное среднее значение распределения построенной гистограммы области,прошедшей фильтр[12, 13].Статистическую обработку полученных данных произвели с помощью программы STATISTICA(dataanalysissoftwaresystem) StatSoft, Inc., 2011 версии 10.0 и MedCalc12.6.1.0. (MedCalcSoftwarebvba) в среде WINDOWS.Применены процедуры описательных статистик, методы ROCанализа[15, 16, 17].Результатыи обсуждениеУчитывая характер снимаемой информации данные имели определенную степень неоднородности, а именно, были представлены как качественными, так и количественными значениями. Для качественных данных использовалась процедура учета абсолютных и относительных частот[15]. Результаты этого оценивания снятой информации методом полуколичественной оценки представлены в таблице 1 и на рисунке 9.Таблица 1 Описание полуколичественной оценки
Интенсивность окраскиАбсолютнаячастотаОтносительнаячастотаСлабо положительная187,03%Умеренно положительная3814,84%Выраженная20078,13%
Рис. 9.Описание данных метода полуколичественной оценки
Следует отметить что при этом методе оценки выраженности экспрессии гена PCNAпрактически все случаи (78,13%) были верифицированы как выраженная степень экспрессии[18].Далее оценилипрогностическуюсостоятельностьметода полуколичественной оценки с помощью анализа характеристических кривых[16, 17]. Визуальное оценивание полученной ROCкривой (рис. 10)наводит на мысль о низкой характерологической способности критерия.Это подтверждают дальнейшие вычисления (табл. 2).Таблица 2Анализ характеристической кривой метода полуколичественной оценки
ПеременнаяПолуколичественная оценкаКлассифицирующая переменнаяВыживаемостьПлощадь под кривой
0,53Стандартная ошибка
0,1295% доверительный интервалот0,329до 0,722Уровень значимостиP(Площадь=0.5)0,81КритерийЧувствительность95%доверительный интервалСпецифичность95%Доверительный интервал+LRLR102*25,00от7,4до 52,481,82от48,2до 97,21,380,92
+LR:
Положительное отношение правдоподобияLR:
Отрицательное отношение правдоподобия
Рис.10.Характеристическая кривая полуколичественной оценки PCNA
Так площадь под кривой имела значение 0,53, что практически не дает ей возможность «оторваться» от бесполезного классификатора.На следующем этапе были описаны количественные данные, полученные с использованиемметодики Histochemicalscore.Результаты представлены в таблице 3.Таблица 3Описательная статистика данных методики Histochemicalscore
ПеременнаяКоличество исследованийСреднее значениеДоверительный интервал95,000%Доверительный интервал95,000%МинимумМаксимумСтд. ОтклонениеСтд. ошибкаHistochemicalscore256212,52193,22231,8250,00278,0048,799,39
После чего,аналогичным образомпроизвели оценку вариационного ряда на возможность бинарного деления процедурой ROCанализа.При визуальной оценке (рис. 11)построенной ROCкривойследует отметить факт выпадения части этой кривой ниже линии разделения, что не могло не сказаться на дальнейшей процедуре проводимого анализа.Его результаты представлены в таблице 4. Следует отметить, что площадь под кривой имела такое же (0,53) не высокое значение.Таблица 4Анализ характеристической кривой метода Histochemical score
ПеременнаяHistochemical scoreКлассифицирующая переменнаяВыживаемостьПлощадь под кривой
0,53Стандартная ошибка
0,1195%доверительный интервал
от0,334до 0,727Уровень значимостиP(Площадь=0.5)0,77КритерийЧувствительность95%Доверительный интервалСпецифичность95%Доверительный интервал+LRLR�197*68,7541,4
88,954,5523,5
83,11,510,57+LR:
Положительное отношение правдоподобияLR:
Отрицательное отношение правдоподобия
Рис.11.Характеристическая кривая оценки PCNAметодикой Histochemical score
Аналогичным образом были описаны данные, снятыеметодом программноаппаратной оценки.Ее результаты представлены в таблице 5.Таблица 5
Описание информации, снятой методом программноаппаратной оценки
ПеременнаяКоличество исследованийСреднее значениеДоверительный интервал95,000%Доверительный интервал95,000%МинимумМаксимумСтд. ОтклонениеСтд. ошибкаПрограммноаппаратная оценка256106,64101,08112,1965,77153,7722,232,78
Итак жепровели оценку характеристической кривой данной методики (рис. 12и табл. 6).
Таблица 6
Анализ характеристической кривой метода программноаппаратной оценки
ПеременнаяПрограммноаппаратная оценкаКлассифицирующая переменнаяВыживаемостьПлощадь под кривой
0,65Стандартная ошибка
0,1095%Доверительный интервал
от0,453 до 0,817Уровень значимостиP(Площадь=0.5)0,14КритерийЧувствительность95%Доверительный интервалСпецифичность95%Доверительный интервал+LRLR�83,385*61,11от 35,8 до 82,672,73от 39,1до 93,72,240,53+LR:
Положительное отношение правдоподобияLR:
Отрицательное отношение правдоподобия
Рис.12. Характеристическая кривая программноаппаратной оценки
Проводить какоелибо прямое сравнение методов учета выраженности экспрессии смыслане имеет, по причине разного калибра используемых шкал. Вместе с тем ROCанализ позволяет оценить значимостьразличий и преимущество того или иного метода оценивания[17]. Процедурой оценивания всех трех характеристических кривых выявлено преимущество программноаппаратной методики перед двумя другими[19]. Графически это представлено на рисунке 13.В таблице 7 приведены сводные данные по площадям трех методик с указанием 95% доверительных интервалов.Таблица 7
Анализ характеристических кривых методов оценки PCNAПеременная1Histochemical scoreПеременная2Полуколичественная оценкаПеременная3Программноаппаратная оценкаКлассифицирующая переменнаяВыживаемость
ПеременныеПлощадь под кривойСтандартная ошибка95%Доверительный интервалГистосчет0,530,11от 0,334 до 0,727Полуколичественная оценка0,530,12от 0,329до 0,722Программноаппаратная оценка0,610,11от 0,403до 0,788
Рис.13.Анализ характеристических кривых методов оценки PCNA
При ближайшем рассмотрении трёх методик оценки PCNAв виде результатов процедуры анализа характеристических кривых с вычислением площади под ними выявили, что максимальная площадь под кривой принадлежит методике программноаппаратной оценки пролиферативнойактивности (см. рис. 1013, табл. 2,4,6,7). Таким образом, использование методики программноаппаратной оценки экспрессии маркеравидится наиболее перспективным для построения прогнозов[5, 9, 20]. Так же разработанная методика программноаппаратной оценки оказалась наиболее быстрой и лёгкойв использовании.ВыводыВ процессе постановки диагноза, равно как и построения прогнозов, данные лабораторных исследований в большинстве случаев играют лишь вспомогательную роль, и, несмотря на появление новых современных методов клинического обследования онкологических больных, и сейчас ни у кого не вызывает сомнения то обстоятельство, что лишь детальная морфологическая характеристика новообразования может дать возможность клиницисту обоснованно, а главное адресно выбрать тактику лечения конкретного онкобольного[21]. В связи с чемразработанная методика программноаппаратной оценки количественно выраженного представления экспрессииPCNAявляется более объективной, точной и простой в использовании, а такженаиболее значимой в построении прогнозов, чем остальные. Данный показатель можно успешно использовать в создании прогностических моделей лишь совместно с дополнительными предикторами.
Ссылки на источники1.Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека [Текст]: Руководство для врачей /Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. ‒ 4е изд., доп. иперераб.–Казань, 2013. –624с.2.Naryzhny S.N. Role of PCNA Interactions in cancer: proteomics view [Текст] /S.N. Naryzhny, H Lee //Materials of the HUPO 8thAnnual World Congress, Toronto, Canada, 2009 –Clinical Proteomics. –2009. V.5. S1. –72p.3.Shi M. A networkbased gene expression signature informs prognosis and treatment for colorectal cancer patients [Текст] /M. Shi,R.D. Beauchamp, B. Zhang //PLoS One. –2012. –7(7). –e41292.4.Vasile L. Prognosis of colorectal cancer: clinical, pathological and therapeutic correlation [Текст] /L. Vasile, A. Olaru, M. Munteanu et all //Rom J Morphol Embryol. –2012. –53(2). –383391p.5.SanzPamplona R. Clinical value of prognosis gene expression signatures in colorectal cancer: a systematic review [Текст] /R. SanzPamplona, A. Berenguer, D. Cordero et all //PLoS One. –2012. –7(11). –e488776.Нарыжный С.Н. К вопросу об онкомаркерах: о чем нам может рассказать PCNA? [Текст] //Медикогенетические проблемы онкологических заболеваний: сб. материалов Всерос. науч. конф., Стерлитамак, 1718 нояб. 2010 г. /Креативная Хирургия и Онкология. 2010. №.4 (Приложение). C.43.7.Naryzhny S.N. Proliferating cell nuclear antigen in the cytoplasm interacts with components of glycolysis and cancer [Текст] /S.N. Naryzhny, H. Lee //FEBS Lett. –2010 Oct. –584(20). –42924298p.8.Legolvan M.P. Application of molecular techniques in the diagnosis, prognosis andmanagement of patients with colorectal cancer: a practical approach[Текст] /M.P. Legolvan, R.J. Taliano, M.B. Resnick //Hum Pathol. –2012 Aug. –43(8). –11571168p.9.Kovac D. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) as a prognostic factor for colorectal cancer [Текст] /D. Kovac, M. Rubinic, M. Krasevic et all //Anticancer Res. –1995 SepOct. –15(5B). –23012302 p.10.Qasim B.J.Immunohistochemical expression ofPCNAand CD34 incolorectaladenomas and carcinomas using specified automated cellular image analysis system: a clinicopathologic study[Текст] /B.J. Qasim, H.H. Ali, A.G. Hussein et all//Gastroenterol. –2012 JulAug. –18(4). –268276p.11.Панченко К.И. Учет морфологических особенностей эпителиев в прогнозировании выживаемости больных раком различных локализаций [Текст] /К.И. Панченко, Л.Б. Шубин, В.А. Макарова и др. //Морфология (архив анатом. гистол. эмбриол). –2010. –Т. 137, вып. 4. –С. 225.12.Dougherty G.Digital Image Processing for Medical Applications[Текст] /G. Dougherty//Cambridge University Press,2009. –462p.13.Girish V.Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ[Текст] /V. Girish, A. Vijayalakshmi //Indian J Cancer –2004. –41(1). –47p.14.Collins T.J. ImageJ for microscopy [Текст] /T.J. Collins//BioTechniques.–2007 Jul. –43(1). –2530p.15.Боровиков В.П. STATISTICA. Искусство анализа данных на компьютере /В.П. Боровиков. –СПб: Питер, 2003. –688с.16.Armitage P. Statistical methods in medical research [Текст] /P. Armitage, G. Berry, J.N.S. Matthews –4th ed. Blackwell Science, 2002. –610p.17.Zweig M.H. Receiveroperating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine [Текст] /M.H. Zweig, G. Campbell //Clin. Chem. –1993 Apr. –39(4). –561577p.18.Akagi Y. Prognostic impact of lymphatic invasion of colorectal cancer: a singlecenter analysis of 1,616 patients over 24 years [Текст] /Y. Akagi, Y. Adachi, T. Ohchi et all //Anticancer Res. –2013 Jul. –33(7). –29652970p.19.Fred C. Pampel Logistic Regression: A Primer. [Текст] /Pampel, Fred C. –1 ed. SAGE Publications, Inc, 2000. –96p.20.Goéré D. Incidence and prognosis of synchronous colorectal carcinomatosis [Текст] /D. Goéré, M.A. Allard, C. Honoré et all //Future Oncol. –2013 Apr. –9(4). –541549p.21.Состояние онкологической помощи населению России в 2011 году [Текст] /Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой //Москва: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России. –2012. –240с.
Leonid Shubin,
сandidateof Medical Sciences, Associate Professor, Department of Pathological Anatomy with Forensic Medicine course and Institute of Postgraduate Education YarSMA, Yaroslavllbsh@yandex.ruVitaly Savgachev,
Clinical intern, Institute of Postgraduate Education YarSMA, Yaroslavlhirurg2288@mail.ruKirill Vsemirnov,
6 year medical student faculty YarSMA, Yaroslavllbsh@yandex.ruNatalia Morozova,
5th year student of medical faculty YarSMA, Yaroslavlmoronya1992@mail.ruYurii Gorbachev,
6 year medical student faculty YarSMA, Yaroslavlsab_anshtane@mail.ruDaria Gorbacheva,
6 year medical student faculty Yagma, Yaroslavlparadigma91@mail.ruComparative analysis of gene expression evaluation PCNA using various techniquesAbstract.The solution to the problem that arises with regard to criteria for building prognostic assessments fate of cancer patients. Studied 256 cases of colon cancer. All material was withdrawnprosectorium of Yaroslavl and Yaroslavl region for the period 2005 to 2012. Each case was submitted preparations stained with antisera labeled with horseradish peroxidase (PCNA). A comparative analysis of the three ways to assess gene expression PCNA by ROCanalysis. The optimal of existing software and hardware method.Keywords:cancer, proliferation, PCNA, survival prognosis.
