Роль условно-патогенной микрофлоры в развитии иммунопатологических реакций при Эпштейна-Барр вирусной инфекции
Международная
публикация
М.
А. КимБиблиографическое описание статьи для цитирования:
Ким
М.
А. Роль условно-патогенной микрофлоры в развитии иммунопатологических реакций при Эпштейна-Барр вирусной инфекции // Научно-методический электронный журнал «Концепт». –
2014. – Т. 20. – С.
736–740. – URL:
http://e-koncept.ru/2014/54411.htm.
Аннотация. Статья посвящена изучению апоптогенной активности микробов-ассоциантов Эпштейна-Барр вирусной инфекции на модели перитонеальных макрофагов мышей in vitro. Оценку апоптоза, индуцированного бактериями, выделенными от больных Эпштейна-Барр вирусной инфекцией, осуществляли по характерным морфологическим изменениям макрофагов.
Текст статьи
Ким Марина Анатольевна,ассистент кафедры детских инфекционных болезней,ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университетМинздрава России», г.РостовнаДонуmarinakim.an@mail.ru
Роль условнопатогенной микрофлорыв развитии иммунопатологических реакций при ЭпштейнаБарр вирусной инфекции
Аннотация.Статья посвящена изучениюапоптогенной активности микробовассоциантовЭпштейнаБарр вирусной инфекциина модели перитонеальных макрофагов мышей invitro. Оценку апоптоза, индуцированного бактериями, выделенными от больных ЭпштейнаБарр вирусной инфекцией, осуществляли по характерным морфологическим изменениям макрофагов.
Ключевые слова:вирус ЭпштейнаБарр, микробыассоцианты, макрофаги, апоптогенный эффект.
ВВЕДЕНИЕЭпштейнаБарр вирусная инфекция (ЭБВИ)обнаруживается повсеместно и относится к одной из наиболее распространенныхи значимых в структуре детской инфекционной патологии. В настоящее время во многих регионах Россиирегистрируетсяповышениезаболеваемостиострой ЭБВИ в формеинфекционногомононуклеоза(ИМ). Так, по данным Роспотребнадзора, показатель заболеваемости ИМв Ростовской области в 2000 г. составлял 3,79, а в 2013 г. –уже 38,97 на 100 тыс. детского населения[1]. Интерес к проблемеЭБВИв последние годы вызван не только ростом заболеваемости, но и появлением новых трактовок клинической картины, непредсказуемостью исходовданной патологии.Обусловленоэтоспецифической тропностью вируса к иммунокомпетентным клеткам, системным поражением внутренних органов, склонностью к развитию хронического рецидивирующего процесса.Исследованиями последних лет доказано, что связан данный факт со способностью вирусаускользать от иммунного ответа, блокируя апоптоз ЭБВ положительных Влимфоцитов.Обычно апоптоз инфицированных клеток является защитной реакцией организма хозяина на появление инфекционного агента, так как гибель клеток способствует быстрой элиминации патогена. Однако многие возбудители, в том числе ЭБВ, подавляют программированную клеточную гибель, тем самым повышая свою выживаемостьи обеспечивая длительную персистенцию в организме[2, 3, 4].Тропизмк иммунокомпетентным клеткам, эпителию слизистой носоглоткидает возможность ЭБВоказывать не только общее, но и локальное повреждение, что приводит к снижению мукоциллиарной защиты[5, 6]. Это,в свою очередь,создает условия для активации условнопатогенной микрофлоры в очагах инфекции, в том числе,небных миндалинах, с формированием микстинфекций[2, 7].Сочетанное воздействие вируснобактериальных ассоциаций на организм, в частности, иммунокомпетентные клетки,неизбежно увеличивает риск развития неблагоприятных исходовзаболевания.В связи с этим, представляет интерес изучение бактериальной составляющей инфекционного процесса и ее влияние на течение заболевания.Следует отметить, что необходимо учитывать не только родовую и видовую принадлежность выделенного микроорганизма, но и патогенный потенциал штамма.Так, многие бактерии обладают механизмами, направленными на управление клеточнойгибелью, что позволяет им поддерживать оптимальные условия развития инфекционного процесса. Механизмы индукции и подавления апоптоза, выработанные микроорганизмами, весьма разнообразны и реализуются в результате сложного взаимодействия биологически активных бактериальных молекул с конкретными мишенями сигнальных путей, ведущих к апоптозу [8].
Известно, что некоторые бактериимогут индуцировать программированную клеточную гибель, используя свои факторы патогенности, что является необходимым этапом вызываемого ими инфекционного процесса. Так, индукция микробами апоптоза макрофагов защищает бактерии от фагоцитоза, способствуя их выживанию. В том случае, когда макрофаги защищают мукозальный слой от проникновения бактерий, апоптоз макрофагов создает условия дляпроникновения возбудителя в подлежащие ткани, кровь и другие органы.Особое значение апоптоз имеет для иммунной системы –одной из главных гомеостатических систем организма, так как жизненный цикл иммунокомпетентных клеток характеризуется многократными процессами активации, дифференцировки и пролиферации. Контролируемый апоптоз рассматривается как главный механизм поддержания оптимального баланса в иммунной системе. На современном этапе уже ни у кого не вызывает сомнений тот факт, что иммунологические механизмы так или иначе участвуют в развитии практически любых патологических состояний, в том числе инфекционного процесса[8].Все вышеперечисленное отражает актуальность проблемысмешанных инфекций в последние годы и все больше притягивает вниманиеразличных исследователей[9, 10, 11].Одним из важных направлений является определение роли вируснобактериальных ассоциаций в патогенезе заболевания и развитии неблагоприятных исходов.Учитывая, что наиболее значимыми бактериальными агентами, сопровождающими ЭБВИ, являются стрептококки, реже золотистый стафилококк[12], перспективным является исследование воздействия этих микроорганизмов на клетки иммунной системы. Тем более, что роль условнопатогенной микрофлоры при данной инфекции изучена недостаточно. Известно, что у больных ЭБВИ происходит контаминация слизистой ротоглоткиразличными бактериальными агентами [2,12]. Однако о роли микробовассоциантов в развитии иммунопатологических реакций при ЭБВИ данные малочисленны. В связи с этим, целью настоящей работы явилось определение способности микробовассоциантов ЭБВИ индуцировать апоптоз макрофагов мышей.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для исследования использовали штаммы микробовассоциантов (Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa,Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli), выделенные сослизистой ротоглотки детей от 3 до 15 лет (75 чел.), находившихся на стационарном лечении в 6ом детском инфекционном отделении ГБ №1 им. Семашко Н.А. г. РостованаДону с диагнозом «инфекционный мононуклеоз ЭБВэтиологии». Выделение и идентификацию представителей микрофлоры слизистой ротоглотки больных проводили в соответствии с приказом №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клиникодиагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений».ДНКазную активность выделенных штаммов определяли на питательной среде целевого назначения (HiMediaLaboratoriesPvt/LTD), визуализирующей продукцию искомого фермента. Посев проводили бляшками диаметром 0,60,7 мм на плотную поверхность среды с последующим термостатированием при +370С 24 ч. и при +220С 48ч.Наличие и активность ДНКазы оценивали по диаметру зоны изменения цвета среды: более 6 мм –высокая, от 2 до 6 мм –средняя, до 2 мм –низкая.Апоптогенную активностьS. pyogenes, S. viridans, S. aureus, S.epidermidis, P. aeruginosa в отношении перитонеальных макрофаговмышей определяли по методике [8]. Исследование проводили на белых беспородных мышах (1820г) из питомника ФКУЗ «РостовскийнаДону научноисследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора. Умерщвление животных осуществляли методом цервикальной дислокации после предварительной наркотизации с помощью тиопентала натрия в дозе 5 мг/кг. Объектом исследования послужили перитонеальные макрофаги мышей. Клетки выделяли через 4 часа после внутрибрюшинного введения 1% пептонной воды рН 7,2 (2 мл), вызвавшего асептическое воспаление. Макрофаги получали через 4 суток после введения пептона. Взятие клеток проводили промыванием брюшной полости животных средой 199 (10 мл), содержащей 5 ед/мл гепарина, 20% инактивированной при +560С в течение 30 мин. сыворотки крови человека и пенициллин –100 ед/мл. Полученный экссудат смешивали со взвесями исследуемыхштаммов микробовассоциантов густотой 5 КОЕ (500 млн. м.т/мл) в разведениях 1:10 и 1:100 (0,1 мл) и подслаивали под покровное стекло, вложенное в стерильный пенициллиновый флакон. Флаконы, в которых покровные стекла находились на внутренней верхней стенке, инкубировали при +370С в течение часа. Контролем явилась культура макрофагов, к которой добавляли растворитель без микробной взвеси. Затем стекла промывали в 6 порциях стерильного раствора Хенкса, переносили в стерильные пенициллиновые флаконы с 2 мл среды 199 с добавлением 20% инактивированной сыворотки и пенициллина 100 ед/мл и вновь инкубировали при +370С в течение 5 часов. После инкубации стекла подсушивали, фиксировали 20 минут и окрашивали по МайГрюнвальду с докрашиванием по РомановскомуГимзе. Мазки высушивали и с помощью иммерсионного масла и просматривали в микроскопе при увеличении 90x7. В мазках подсчитывали процент клеток с апоптозом. Средний показатель вычисляли по трем экспериментам. При условии обнаружения в контрольных мазках 94±1% жизнеспособных макрофагов подсчитывали процент клеток с апоптозом в опытных образцах. Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов «Microsoft Office 2007» и «Statistica 6.0» для Windows XP. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.РЕЗУЛЬТАТЫИ ОБСУЖДЕНИЕПри исследовании видового составамикрофлорыслизистой ротоглотки у больных ЭБВИ чащевыявлялиобильный рост S.pyogenes (32+17,6%), S.viridans (29,3+17,2%) иS.aureus(17,3 +14,3%). Других представителейусловнопатогенной микрофлоры (S.epidermidis, P.aeruginosa, K.pneumoniae, E.coli) выявлялиреже (в5,3+8,5%; 2,7+6,1%; 1,3+4,3%; 1,3+4,3%случаевсоответственно)по сравнению со S. pyogenes (р<0,05).
При определении фермента ДНКазы оказалось,что высокая степень егоактивности(более 6 мм)была обнаружена у 80% штаммов S. aureus, тогда как остальные исследуемые штаммы (S. pyogenes, S. viridans, S. epidermidis, K. pneumoniae) ею не обладали.Все исследованные микроорганизмы (табл. 1), выделенные от больных ЭБВИ, в разной степени обладали способностью индуцировать процесс программированной клеточной гибели макрофагов белых мышей. Количество клеток с апоптозом колебалось в пределах от 18,7±5,4% до 58,6±6,8% при исследовании микробных взвесей в разведении 1:10; от 11,2±4,3% до 56,0±6,8% в разведении 1:100. Сравнительный анализ результатов апоптогенной активности микробовассоциантов ЭБВИ, выделенных со слизистой оболочки ротоглотки показал, что наиболее высоким патогенным потенциалом обладал S. pyogenes (58,6±6,8%). Это могло быть обусловлено наличием у S. pyogenes токсинов, Ои Sстрептолизинов, поверхностных белковадгезинов, ферментов патогенности. Апоптогенная активность S.viridans была ниже (42,5±6,7%), но превышала таковую S. аureus (21,2±5,4%), P. aeruginosa (20,5±5,1%), S. epidermidis (18,7±5,4%). Следует отметить, что из всех исследованных микробовассоциантов дозозависимый эффект апоптогенной активности был отмечен только у S.viridans.Таблица 1Апоптогенный эффект микробовассоциантов ЭпштейнаБарр вирусной инфекции в отношении макрофагов мышей
ВидКоличество клеток с апоптозом(%±m)1:101:100S. pyogenes58,6±6,8**56,0±6,9**S. viridans42,5±6,7*25,4±6,1*S.aureus21,2±5,4*, **13,6±4,7*, **P. aeruginosa20,5±5,1*, **11,2±4,3*, **S. epidermidis18,7 ±5,4*,**19,3±5,6*, **Условные обозначения:* достоверность различий между показателями апоптоза, индуцированного S. pyogenesи аналогичными показателями других микроорганизмов при одинаковых разведениях;
** достоверность различий между показателями апоптоза, индуцированного S. viridansи аналогичными показателями других микроорганизмов при одинаковых разведениях
Известно, что функциональное состояние иммунокомпетентных клеток,их адаптационные возможности и способность к формированию полноценной межклеточной кооперации определяют возможность сопротивления иммунной системы.Так, вирус ЭпштейнаБарр, находясь в иммунокомпетентной клетке, для поддержания жизнедеятельности синтезирует специфические белки, блокирующие ее апоптоз. Это обеспечиваетпожизненную персистенцию возбудителя в органах и тканях сформированиемвторичного иммунодефицитного состояния. Ослабление резистентности макроорганизма на фоне депрессии Тклеточного иммунитетаявляется патогенетически значимым фактором для хронизации, рецидивирующего течения ЭБВИ и развития осложнений [3,13,14].
По результатам нашего исследования установлено, что бактериальная микрофлора способна влиять на процесс программированной клеточной гибели иммунокомпетентных клеток. Механизмы апоптогенного действия микроорганизмов различны и могут быть связаны с угнетением процессов синтеза белка, повреждением цитоплазматической и митохондриальной мембран, проникновением эффекторных молекул в клетки хозяина и др.Причем, микроорганизмы могут использовать одномоментно несколько механизмов апоптогенного действия, интерференция которых при сочетанном воздействии на клетки и обусловливает повышение или снижение процессов программированной гибели клеток [4].Наиболее выраженный апоптогенный эффект выявлен уS. pyogenes, следующимпо значимости в альтерации перитонеальных макрофагов отмечен S. viridans.Индукция микробами апоптоза макрофагов защищает бактерии от фагоцитоза, способствуя их выживанию и создавая условия для их проникновения в органы и ткани[8]. Возникновение иммуносупрессии, способность ВЭБ поражать эпителий ротоглотки является тем патогенетическим фоном, который способствует присоединению/активации бактериальной микрофлоры.И, наоборот, массивная бактериальная колонизация слизистых оболочек может привести к реактивации вирусной инфекции.А, как известно, воздействие на организм вируснобактериальных ассоциаций приводит к усугублению патологического процесса [1,9].
ЗАКЛЮЧЕНИЕВсе микробыассоцианты (S. pyogenes, S. viridans, S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa), выделенные от больных ЭБВИ обладали апоптогенной активностью разной степени, что может служить способом их выживания и длительной персистенции в организме. Наиболее выраженная способность индуцировать процесс программированной клеточной гибели перитонеальных макрофагов мышей выявлена у стрептококков,в частности, S.pyogenes, что позволяет его расценивать как наиболее опасного микробаассоцианта ЭБВИ.
Ссылки на источники1.Федеральное статистическое наблюдение –форма №2 «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях за 2013 год по Ростовской области»2.Аистова Л.Г., Сильчук Н.В., Половица Н.В. Микстгерпетическая инфекция при ангинах у детей //Дальневосточный журнал инфекционной патологии.–2012.№21. –С.6062.3.Klein G., Klein E., Kashuba E. Interaction of EpsteinBarr virus (EBV) with human Blymphocytes// Biochemical and biophysical research communications. –2010. –Vol.1, №396. –P. 6773.4.Moss, J.E., Aliprantis A.O., Zychlinsky A. The regulation of apoptosis by microbial pathogens// Int. Rev. Cytol. –1999. –№187. –P. 203259.5.The role of viruses in the pathogenesis of peritonsillar abscess/ Rusan M. [et al.] // European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. –2012. –Vol.90, №З1. –P. 23352343.6.EpsteinBarr virus in oral diseases / Slots J.[et al.] //Journal of periodontal research.–2006. –Vol.41,№4З. –P. 235244.7.Stenfors L.E., Bye H.M., Raisanen S. Noticeable differences in bacterial defence on tonsillar surfaces between bacteriainduced and virusinduced acute tonsillitis // International Journal оf Pediatric Otorhinolaryngology. –2003. –Vol.67, №10. –P.10751082.8.Тюкавкина С.Ю. Роль апоптоза в формировании иммунопатологических процессов, способствующих развитию инфекционных заболеваний // Иммунология. –2013. –№1. –С. 5257.9.Нестерова И.В. Интерферонои иммунотерапия в лечении иммунокомпрометированных пациентов с рецидивирующими вируснобактериальными инфекциями //Аллергология и иммунология. –2012. –№2. –С. 170172.10.Slots J. Herpesvirus periodontitis: infection beyond biofilm // J. Calif. Dent. Assoc. –2011. –Vol.39, №6. –P. 39339911.Viralbacterial associations in acute apical abscesses /Ferreira D.C. [et al.] // Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. –2011. –Vol.112, №2. –P. 264271.12.Использованиеиммуномодулирующей терапии в лечении пациентов с хроническим тонзиллитом, ассоциированным с вирус ЭпштейнаБарр инфекцией / Е.В. Маркелова [и др.] // Фундаментальные исследования. –2013. –№5. –С. 324327.13.Гервазиева В.Б., Самойликов П.В. Взаимодействие вирусов семейства Herpesviridae с иммунной системой человека //Аллергология и иммунология. –2010. –№11. –С. 3141.14.Крамарев С.А., Тарадий Н.Н., Выговская О.В. Состояние апоптоза при острой Эпштейна —Барр вирусной инфекции у детей // Здоровье ребенка. –2013. –№7. –С. 151156.
Kym Marina,The assistant lecture of department of children inflectional diseases of SBEE HPE RostSMU Ministry of Health of Russia, RostovonDon.marinakim.an@mail.ruThe role of conditionally pathogenic microflora in the immune pathologic reactions development at EpsteinBarr virus infectionAbstract.The present article is concerned with studying of appoptogenic activity of microbes associated with EpsteinBarr virus infection on model of peritoneal mice macrophages in vitro. The estimation of apoptosis induced by bacterias extracted from patients with EpsteinBarr virus infection was carried out oncharacteristic morphologic changes of macrophages. It was established that apoptogenic activity had all microbes associated with EpsteinBarr virus infection, but the highiest pathogenic potential Streptococcus pyogenes. Presence of apoptogenic activity of bacterial microflora associated with EpsteinBarr virus infection towards immune system cells can serve as pathway of their survival and can be the pathogenic base of their long persistence in the body. The expressed ability of Streptococcus pyogenes to induce the apoptosis can give us the possibility to consider such microbe as the most dangerous microbe associated with EpsteinBarr virus infection.Key words:EpsteinBarr virus, microbes associated with something, macrophages, apoptogenic effect.
Роль условнопатогенной микрофлорыв развитии иммунопатологических реакций при ЭпштейнаБарр вирусной инфекции
Аннотация.Статья посвящена изучениюапоптогенной активности микробовассоциантовЭпштейнаБарр вирусной инфекциина модели перитонеальных макрофагов мышей invitro. Оценку апоптоза, индуцированного бактериями, выделенными от больных ЭпштейнаБарр вирусной инфекцией, осуществляли по характерным морфологическим изменениям макрофагов.
Ключевые слова:вирус ЭпштейнаБарр, микробыассоцианты, макрофаги, апоптогенный эффект.
ВВЕДЕНИЕЭпштейнаБарр вирусная инфекция (ЭБВИ)обнаруживается повсеместно и относится к одной из наиболее распространенныхи значимых в структуре детской инфекционной патологии. В настоящее время во многих регионах Россиирегистрируетсяповышениезаболеваемостиострой ЭБВИ в формеинфекционногомононуклеоза(ИМ). Так, по данным Роспотребнадзора, показатель заболеваемости ИМв Ростовской области в 2000 г. составлял 3,79, а в 2013 г. –уже 38,97 на 100 тыс. детского населения[1]. Интерес к проблемеЭБВИв последние годы вызван не только ростом заболеваемости, но и появлением новых трактовок клинической картины, непредсказуемостью исходовданной патологии.Обусловленоэтоспецифической тропностью вируса к иммунокомпетентным клеткам, системным поражением внутренних органов, склонностью к развитию хронического рецидивирующего процесса.Исследованиями последних лет доказано, что связан данный факт со способностью вирусаускользать от иммунного ответа, блокируя апоптоз ЭБВ положительных Влимфоцитов.Обычно апоптоз инфицированных клеток является защитной реакцией организма хозяина на появление инфекционного агента, так как гибель клеток способствует быстрой элиминации патогена. Однако многие возбудители, в том числе ЭБВ, подавляют программированную клеточную гибель, тем самым повышая свою выживаемостьи обеспечивая длительную персистенцию в организме[2, 3, 4].Тропизмк иммунокомпетентным клеткам, эпителию слизистой носоглоткидает возможность ЭБВоказывать не только общее, но и локальное повреждение, что приводит к снижению мукоциллиарной защиты[5, 6]. Это,в свою очередь,создает условия для активации условнопатогенной микрофлоры в очагах инфекции, в том числе,небных миндалинах, с формированием микстинфекций[2, 7].Сочетанное воздействие вируснобактериальных ассоциаций на организм, в частности, иммунокомпетентные клетки,неизбежно увеличивает риск развития неблагоприятных исходовзаболевания.В связи с этим, представляет интерес изучение бактериальной составляющей инфекционного процесса и ее влияние на течение заболевания.Следует отметить, что необходимо учитывать не только родовую и видовую принадлежность выделенного микроорганизма, но и патогенный потенциал штамма.Так, многие бактерии обладают механизмами, направленными на управление клеточнойгибелью, что позволяет им поддерживать оптимальные условия развития инфекционного процесса. Механизмы индукции и подавления апоптоза, выработанные микроорганизмами, весьма разнообразны и реализуются в результате сложного взаимодействия биологически активных бактериальных молекул с конкретными мишенями сигнальных путей, ведущих к апоптозу [8].
Известно, что некоторые бактериимогут индуцировать программированную клеточную гибель, используя свои факторы патогенности, что является необходимым этапом вызываемого ими инфекционного процесса. Так, индукция микробами апоптоза макрофагов защищает бактерии от фагоцитоза, способствуя их выживанию. В том случае, когда макрофаги защищают мукозальный слой от проникновения бактерий, апоптоз макрофагов создает условия дляпроникновения возбудителя в подлежащие ткани, кровь и другие органы.Особое значение апоптоз имеет для иммунной системы –одной из главных гомеостатических систем организма, так как жизненный цикл иммунокомпетентных клеток характеризуется многократными процессами активации, дифференцировки и пролиферации. Контролируемый апоптоз рассматривается как главный механизм поддержания оптимального баланса в иммунной системе. На современном этапе уже ни у кого не вызывает сомнений тот факт, что иммунологические механизмы так или иначе участвуют в развитии практически любых патологических состояний, в том числе инфекционного процесса[8].Все вышеперечисленное отражает актуальность проблемысмешанных инфекций в последние годы и все больше притягивает вниманиеразличных исследователей[9, 10, 11].Одним из важных направлений является определение роли вируснобактериальных ассоциаций в патогенезе заболевания и развитии неблагоприятных исходов.Учитывая, что наиболее значимыми бактериальными агентами, сопровождающими ЭБВИ, являются стрептококки, реже золотистый стафилококк[12], перспективным является исследование воздействия этих микроорганизмов на клетки иммунной системы. Тем более, что роль условнопатогенной микрофлоры при данной инфекции изучена недостаточно. Известно, что у больных ЭБВИ происходит контаминация слизистой ротоглоткиразличными бактериальными агентами [2,12]. Однако о роли микробовассоциантов в развитии иммунопатологических реакций при ЭБВИ данные малочисленны. В связи с этим, целью настоящей работы явилось определение способности микробовассоциантов ЭБВИ индуцировать апоптоз макрофагов мышей.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для исследования использовали штаммы микробовассоциантов (Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa,Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli), выделенные сослизистой ротоглотки детей от 3 до 15 лет (75 чел.), находившихся на стационарном лечении в 6ом детском инфекционном отделении ГБ №1 им. Семашко Н.А. г. РостованаДону с диагнозом «инфекционный мононуклеоз ЭБВэтиологии». Выделение и идентификацию представителей микрофлоры слизистой ротоглотки больных проводили в соответствии с приказом №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клиникодиагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений».ДНКазную активность выделенных штаммов определяли на питательной среде целевого назначения (HiMediaLaboratoriesPvt/LTD), визуализирующей продукцию искомого фермента. Посев проводили бляшками диаметром 0,60,7 мм на плотную поверхность среды с последующим термостатированием при +370С 24 ч. и при +220С 48ч.Наличие и активность ДНКазы оценивали по диаметру зоны изменения цвета среды: более 6 мм –высокая, от 2 до 6 мм –средняя, до 2 мм –низкая.Апоптогенную активностьS. pyogenes, S. viridans, S. aureus, S.epidermidis, P. aeruginosa в отношении перитонеальных макрофаговмышей определяли по методике [8]. Исследование проводили на белых беспородных мышах (1820г) из питомника ФКУЗ «РостовскийнаДону научноисследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора. Умерщвление животных осуществляли методом цервикальной дислокации после предварительной наркотизации с помощью тиопентала натрия в дозе 5 мг/кг. Объектом исследования послужили перитонеальные макрофаги мышей. Клетки выделяли через 4 часа после внутрибрюшинного введения 1% пептонной воды рН 7,2 (2 мл), вызвавшего асептическое воспаление. Макрофаги получали через 4 суток после введения пептона. Взятие клеток проводили промыванием брюшной полости животных средой 199 (10 мл), содержащей 5 ед/мл гепарина, 20% инактивированной при +560С в течение 30 мин. сыворотки крови человека и пенициллин –100 ед/мл. Полученный экссудат смешивали со взвесями исследуемыхштаммов микробовассоциантов густотой 5 КОЕ (500 млн. м.т/мл) в разведениях 1:10 и 1:100 (0,1 мл) и подслаивали под покровное стекло, вложенное в стерильный пенициллиновый флакон. Флаконы, в которых покровные стекла находились на внутренней верхней стенке, инкубировали при +370С в течение часа. Контролем явилась культура макрофагов, к которой добавляли растворитель без микробной взвеси. Затем стекла промывали в 6 порциях стерильного раствора Хенкса, переносили в стерильные пенициллиновые флаконы с 2 мл среды 199 с добавлением 20% инактивированной сыворотки и пенициллина 100 ед/мл и вновь инкубировали при +370С в течение 5 часов. После инкубации стекла подсушивали, фиксировали 20 минут и окрашивали по МайГрюнвальду с докрашиванием по РомановскомуГимзе. Мазки высушивали и с помощью иммерсионного масла и просматривали в микроскопе при увеличении 90x7. В мазках подсчитывали процент клеток с апоптозом. Средний показатель вычисляли по трем экспериментам. При условии обнаружения в контрольных мазках 94±1% жизнеспособных макрофагов подсчитывали процент клеток с апоптозом в опытных образцах. Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов «Microsoft Office 2007» и «Statistica 6.0» для Windows XP. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.РЕЗУЛЬТАТЫИ ОБСУЖДЕНИЕПри исследовании видового составамикрофлорыслизистой ротоглотки у больных ЭБВИ чащевыявлялиобильный рост S.pyogenes (32+17,6%), S.viridans (29,3+17,2%) иS.aureus(17,3 +14,3%). Других представителейусловнопатогенной микрофлоры (S.epidermidis, P.aeruginosa, K.pneumoniae, E.coli) выявлялиреже (в5,3+8,5%; 2,7+6,1%; 1,3+4,3%; 1,3+4,3%случаевсоответственно)по сравнению со S. pyogenes (р<0,05).
При определении фермента ДНКазы оказалось,что высокая степень егоактивности(более 6 мм)была обнаружена у 80% штаммов S. aureus, тогда как остальные исследуемые штаммы (S. pyogenes, S. viridans, S. epidermidis, K. pneumoniae) ею не обладали.Все исследованные микроорганизмы (табл. 1), выделенные от больных ЭБВИ, в разной степени обладали способностью индуцировать процесс программированной клеточной гибели макрофагов белых мышей. Количество клеток с апоптозом колебалось в пределах от 18,7±5,4% до 58,6±6,8% при исследовании микробных взвесей в разведении 1:10; от 11,2±4,3% до 56,0±6,8% в разведении 1:100. Сравнительный анализ результатов апоптогенной активности микробовассоциантов ЭБВИ, выделенных со слизистой оболочки ротоглотки показал, что наиболее высоким патогенным потенциалом обладал S. pyogenes (58,6±6,8%). Это могло быть обусловлено наличием у S. pyogenes токсинов, Ои Sстрептолизинов, поверхностных белковадгезинов, ферментов патогенности. Апоптогенная активность S.viridans была ниже (42,5±6,7%), но превышала таковую S. аureus (21,2±5,4%), P. aeruginosa (20,5±5,1%), S. epidermidis (18,7±5,4%). Следует отметить, что из всех исследованных микробовассоциантов дозозависимый эффект апоптогенной активности был отмечен только у S.viridans.Таблица 1Апоптогенный эффект микробовассоциантов ЭпштейнаБарр вирусной инфекции в отношении макрофагов мышей
ВидКоличество клеток с апоптозом(%±m)1:101:100S. pyogenes58,6±6,8**56,0±6,9**S. viridans42,5±6,7*25,4±6,1*S.aureus21,2±5,4*, **13,6±4,7*, **P. aeruginosa20,5±5,1*, **11,2±4,3*, **S. epidermidis18,7 ±5,4*,**19,3±5,6*, **Условные обозначения:* достоверность различий между показателями апоптоза, индуцированного S. pyogenesи аналогичными показателями других микроорганизмов при одинаковых разведениях;
** достоверность различий между показателями апоптоза, индуцированного S. viridansи аналогичными показателями других микроорганизмов при одинаковых разведениях
Известно, что функциональное состояние иммунокомпетентных клеток,их адаптационные возможности и способность к формированию полноценной межклеточной кооперации определяют возможность сопротивления иммунной системы.Так, вирус ЭпштейнаБарр, находясь в иммунокомпетентной клетке, для поддержания жизнедеятельности синтезирует специфические белки, блокирующие ее апоптоз. Это обеспечиваетпожизненную персистенцию возбудителя в органах и тканях сформированиемвторичного иммунодефицитного состояния. Ослабление резистентности макроорганизма на фоне депрессии Тклеточного иммунитетаявляется патогенетически значимым фактором для хронизации, рецидивирующего течения ЭБВИ и развития осложнений [3,13,14].
По результатам нашего исследования установлено, что бактериальная микрофлора способна влиять на процесс программированной клеточной гибели иммунокомпетентных клеток. Механизмы апоптогенного действия микроорганизмов различны и могут быть связаны с угнетением процессов синтеза белка, повреждением цитоплазматической и митохондриальной мембран, проникновением эффекторных молекул в клетки хозяина и др.Причем, микроорганизмы могут использовать одномоментно несколько механизмов апоптогенного действия, интерференция которых при сочетанном воздействии на клетки и обусловливает повышение или снижение процессов программированной гибели клеток [4].Наиболее выраженный апоптогенный эффект выявлен уS. pyogenes, следующимпо значимости в альтерации перитонеальных макрофагов отмечен S. viridans.Индукция микробами апоптоза макрофагов защищает бактерии от фагоцитоза, способствуя их выживанию и создавая условия для их проникновения в органы и ткани[8]. Возникновение иммуносупрессии, способность ВЭБ поражать эпителий ротоглотки является тем патогенетическим фоном, который способствует присоединению/активации бактериальной микрофлоры.И, наоборот, массивная бактериальная колонизация слизистых оболочек может привести к реактивации вирусной инфекции.А, как известно, воздействие на организм вируснобактериальных ассоциаций приводит к усугублению патологического процесса [1,9].
ЗАКЛЮЧЕНИЕВсе микробыассоцианты (S. pyogenes, S. viridans, S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa), выделенные от больных ЭБВИ обладали апоптогенной активностью разной степени, что может служить способом их выживания и длительной персистенции в организме. Наиболее выраженная способность индуцировать процесс программированной клеточной гибели перитонеальных макрофагов мышей выявлена у стрептококков,в частности, S.pyogenes, что позволяет его расценивать как наиболее опасного микробаассоцианта ЭБВИ.
Ссылки на источники1.Федеральное статистическое наблюдение –форма №2 «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях за 2013 год по Ростовской области»2.Аистова Л.Г., Сильчук Н.В., Половица Н.В. Микстгерпетическая инфекция при ангинах у детей //Дальневосточный журнал инфекционной патологии.–2012.№21. –С.6062.3.Klein G., Klein E., Kashuba E. Interaction of EpsteinBarr virus (EBV) with human Blymphocytes// Biochemical and biophysical research communications. –2010. –Vol.1, №396. –P. 6773.4.Moss, J.E., Aliprantis A.O., Zychlinsky A. The regulation of apoptosis by microbial pathogens// Int. Rev. Cytol. –1999. –№187. –P. 203259.5.The role of viruses in the pathogenesis of peritonsillar abscess/ Rusan M. [et al.] // European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. –2012. –Vol.90, №З1. –P. 23352343.6.EpsteinBarr virus in oral diseases / Slots J.[et al.] //Journal of periodontal research.–2006. –Vol.41,№4З. –P. 235244.7.Stenfors L.E., Bye H.M., Raisanen S. Noticeable differences in bacterial defence on tonsillar surfaces between bacteriainduced and virusinduced acute tonsillitis // International Journal оf Pediatric Otorhinolaryngology. –2003. –Vol.67, №10. –P.10751082.8.Тюкавкина С.Ю. Роль апоптоза в формировании иммунопатологических процессов, способствующих развитию инфекционных заболеваний // Иммунология. –2013. –№1. –С. 5257.9.Нестерова И.В. Интерферонои иммунотерапия в лечении иммунокомпрометированных пациентов с рецидивирующими вируснобактериальными инфекциями //Аллергология и иммунология. –2012. –№2. –С. 170172.10.Slots J. Herpesvirus periodontitis: infection beyond biofilm // J. Calif. Dent. Assoc. –2011. –Vol.39, №6. –P. 39339911.Viralbacterial associations in acute apical abscesses /Ferreira D.C. [et al.] // Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. –2011. –Vol.112, №2. –P. 264271.12.Использованиеиммуномодулирующей терапии в лечении пациентов с хроническим тонзиллитом, ассоциированным с вирус ЭпштейнаБарр инфекцией / Е.В. Маркелова [и др.] // Фундаментальные исследования. –2013. –№5. –С. 324327.13.Гервазиева В.Б., Самойликов П.В. Взаимодействие вирусов семейства Herpesviridae с иммунной системой человека //Аллергология и иммунология. –2010. –№11. –С. 3141.14.Крамарев С.А., Тарадий Н.Н., Выговская О.В. Состояние апоптоза при острой Эпштейна —Барр вирусной инфекции у детей // Здоровье ребенка. –2013. –№7. –С. 151156.
Kym Marina,The assistant lecture of department of children inflectional diseases of SBEE HPE RostSMU Ministry of Health of Russia, RostovonDon.marinakim.an@mail.ruThe role of conditionally pathogenic microflora in the immune pathologic reactions development at EpsteinBarr virus infectionAbstract.The present article is concerned with studying of appoptogenic activity of microbes associated with EpsteinBarr virus infection on model of peritoneal mice macrophages in vitro. The estimation of apoptosis induced by bacterias extracted from patients with EpsteinBarr virus infection was carried out oncharacteristic morphologic changes of macrophages. It was established that apoptogenic activity had all microbes associated with EpsteinBarr virus infection, but the highiest pathogenic potential Streptococcus pyogenes. Presence of apoptogenic activity of bacterial microflora associated with EpsteinBarr virus infection towards immune system cells can serve as pathway of their survival and can be the pathogenic base of their long persistence in the body. The expressed ability of Streptococcus pyogenes to induce the apoptosis can give us the possibility to consider such microbe as the most dangerous microbe associated with EpsteinBarr virus infection.Key words:EpsteinBarr virus, microbes associated with something, macrophages, apoptogenic effect.
