Исследование влияния ПГА-матриксов с различным белковым покрытием на скорость восстановления поврежденных тканей кожи крыс

Международная публикация
Библиографическое описание статьи для цитирования:
Яценко Я. О., Николаева Е. Д. Исследование влияния ПГА-матриксов с различным белковым покрытием на скорость восстановления поврежденных тканей кожи крыс // Научно-методический электронный журнал «Концепт». – 2015. – Т. 13. – С. 4631–4635. – URL: http://e-koncept.ru/2015/85927.htm.
Аннотация. В статье рассматривается проблема создания инновационных биополимерных матриксов, применяемых в реконструктивной медицине для восстановления поврежденных кожных покровов. Приводятся описание и результаты эксперимента по использованию полигидроксиалканоат-матрикса с белковым покрытием на моделируемых дефектах кожных тканей у крыс.
Комментарии
Нет комментариев
Оставить комментарий
Войдите или зарегистрируйтесь, чтобы комментировать.
Текст статьи
Николаева Елена Дмитриевна,кандидат биологических наук, научный сотрудник ИБФ СО РАН, г.Красноярскnikolaevalena@mail.ru

Яценко Яна Олеговна,студент, Сибирский федеральный университет, г.Красноярскiana_iatcenko@list.ru

Исследование влияния ПГАматриксов с различным белковым покрытием на скорость восстановления поврежденных тканей кожикрыс

Аннотация. В статье рассматривается проблема создания инновационных биополимерных матриксов, применяемых в реконструктивной медицине для восстановленияповрежденныхкожных покровов. Приводятся описание и результаты экспериментапо использованию полигидроксиалканоатматрикса с белковым покрытием на моделируемых дефектах кожных тканей у крыс.Ключевые слова: раневое покрытие, эпидермис, биополимер, регенерация, белковое покрытие, белки адгезии.

На протяжении многих лет актуальной проблемой для медицины являетсяразработка эффективных методови материалов, способствующих восстановлениюповрежденныхкожных покровов.Значимостьпроблемыобусловлена тем, что кожныеповрежденияявляются одними изнаиболее распространенных травматических повреждений в мире.К ним относятся повреждения, полученные при ожогах,авариях,на производствеи.т.д.

При этом по летальности исходов первоеместозанимаютповреждения,полученные в автомобильных авариях, второе место–повреждения, полученные в результате ожогов.Таким образом,важность и необходимость исследований в рамках данного раздела регенеративной медицины очевидна. Восстановление слоев эпидермиса, нарушенных в результате травматических воздействий,являетсядлительным и сложным процессом. Поэтомуприоритетной задачей исследований и технологических разработок, связанных с обеспечением регенерации кожных поверхностей, выступает создание эффективных материалов, накладываемых на раны,которыеспособныускорить процесс заживления.В ходеведущихсяисследований свойства и характеристики данных материалов –раневых покрытий –все более совершенствуются,и сегодня на задний планужеотходят такие материалы,как природные раневые покрытия (аллогенная кожа, амниотическая мембрана и др.). В качестве наиболее перспективныхматериалов, отвечающих многим современным требованиям, ученые признают синтетическиераневыепокрытия. Их преимущество, в отличиеот материаловпрошлого поколения, заключается в высокой степени биосовместимостираневых покрытий с кожей.Этообъясняетсямаксимальнойсхожестьюматериала со свойствами организма: синтетические биоматериалы успешно адаптируется к нему; организм не воспринимает его как чужеродный объект и поэтому риск отторжения такого раневого покрытиязначительно сокращается. Еще однонемаловажноесвойствосинтетических раневых покрытий–способность к биодеградируемостит.е. после выполнения своей задачи покрытие утилизируется естественным путем без дополнительных вмешательств со стороны человека[1].К числу синтетических раневых покрытий относится биполимер полигидроксиалканоат (далее –ПГА), получаемый на базе Лабораториибиотехнологии и новых материалов при Сибирском Федеральном Университете.Данный биополимер входит в группубактериальных полиэфиров, которые получают из клеток некоторых микроорганизмов. Их особенностью является то, что они способны накапливать ПГА в клеточной цитоплазме в виде сферических включений. Накопление происходит в специфических условиях несбалансированного роста, когда синтез белков и нуклеиновых кислот ограничен, но в среде находится избыток углерода [2].

Выращивание специфических к накоплению ПГА микроорганизмов, культивирование и получение продукта было оптимизировано на базе научной лабораторииУниверситета. Разработка данного вида биополимера являетсяуникальной, нигде в России он более не производится. В лаборатории производятсяПГА различных форм –2D(пленки, мембраны), 3D(губки, таблетки). Наиболее оптимальной формой биополимера, используемого как раневоепокрытие,являются 2Dматриксыв виде пленоки мембран. Дополнительными к обозначенным выше достоинствам производимого материалараневого покрытия являются также обеспечиваемая им защита раны от неблагоприятного внешнего воздействия, защита от пересыхания, препятствие к формированию плотного струпа, затрудняющегопередвижение, а,следовательно, инарастание новых клеток эпидермиса.

С целью усиленияэффективностираневогопокрытиянамибыла предпринята попыткапротестировать биополимер ПГАс включением в его составмежклеточных белков адгезии, которые образуют межклеточный матрикс клеток. Межклеточный матрикс –это комплекс органических и неорганических компонентов, заполняющих пространство между клетками, и связывающий их, а также является универсальным «биологическим» клеем[3]. В качестве «связывающих» белков были выбраны такие,как фибронектин, желатин и коллаген(IVтип). Предполагаемым результатоможидалосьувеличениескоростипротеканияпроцессарегенерации кожныхтканейзасчет стимулирования адгезии специфическими белками.

Выбор адгезивныхбелков обуславливалсяих свойствами и функциями, выполняемыми в организме. Например, фибронектин способствуют адгезии и распространению эпителиальных и мезенхимальных клеток, стимулирует пролиферацию и миграцию эмбриональных клеток, контролирует дифференцировку и поддержание цитоскелета клеток, активно участвует в воспалительных и репаративных процессах. Это связано с тем, что каждая субъединица фибронектина содержит последовательность АргГлиАсп (RGD), с помощью которой он может присоединяться к клеточным рецепторам (интегринам)[4]. Намитакжебыл выбран коллаген IVтипа, так как он является ключевым структурным компонентом базальных мембран, которые представляют собой особую форму межклеточного матрикса. Его секретируют различные типы клеток: эпителиальные, эндотелиальные, мышечные, нервные, жировые.Структура коллагена специфична и образует сетевидные структуры, достаточно гибкие, что соответствует характеристикам кожи[4]. Тестирование желатинав данном исследованииобусловлено тем, что он является частично гидролизованным белком коллагеном, обладает склеивающей функцией и представляетсобой продукт переработки или денатурации соединительной ткани животных. Итак, все белкиимеютестественноепроисхождениеитак или иначеприсутствуют в организме человека и животных, что минимизирует риск их отторжения при нанесении на рану; выполняемыеими функции коррелируют с цельюнашего исследования –ускорениемпроцессавосстановления кожных тканей.В целом, краткая характеристикаперечисленных белковдает основание предполагать,чтоони потенциально могут быть использованы в качестве белковых покрытий для матриксов ПГА. Для предстоящегоопыта были изготовлены два типа полимерных 2Dматриксов: пленки, мембраны, образованные ультратонким волокном, объемные пористые матриксы (рис. 1).

Рис. 1. Фотографии матриксов: а –пленка; б –мембрана из ультратонких волокон.

Фотографии, сделанные с помощью сканирующего электронного микроскопа, показали отсутствие межмолекулярной связи между поверхностью биополимера и белками, однако на мембранах из ультратонких волокон белковые покрытия держались лучше, что связано с более глубоким проникновением белков внутрь матрикса.Далее спомощью специальной формы пленки и мембраны были нарезаны на дискии помещены в планшеты. На поверхность матриксов наносили растворыбелков и оставляли в ламинаре до полного высыхания растворителя. После этого матриксы проходили стерилизацию ультрафиолетом.Потенциальную цитотоксичность матриксовмыоценивали в реакции с МТТ [3(4,5диметилтиазол2ил)2,5дифенилтетразол бромидом], основанной на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3(4,5диметилтиазол2ил)2,5дифенилтетразол бромид до формазана, что характеризует активность митохондрий живых клеток и косвенно отражает количество жизнеспособных клеток и способность клеток к пролиферации.Для проведения МТТреакции полимерные матриксы засеивали постоянной клеточной линиейэмбриональных фибробластов мыши и линиейфибробластов, выделенных из висцеральной жировой ткани крысы.После манипуляций с исходными материалами было проведено измерение оптической плотности на микропланшетномфотометре. Количество клеток оценивали по предварительно приготовленному калибровочному графику.Также для оценки эффективности роста клеток проводили наблюдение на микроскопе, предварительно окрасив клетки флюорисцентным красителем. По результатам МТТтеста в культуре фибробластов постоянной клеточной линии мыши на матриксах в виде пленок наибольший эффект от белкового покрытия был при использовании коллагена. На мембранах из ультратонких волокон клеток было немного больше –на 310% по сравнению с пленками, что связано с большей площадью доступной поверхности, при этом наблюдалась такая же тенденция относительно белковых покрытий.Окрашивание клеток на матриксах флуорисцентными красителями показало, что клетки былихорошо распластаны на матриксахс покрытием коллагеном и фибронектином. На матриксах с желатином клеток было меньше, преобладали клетки ошаренной формы, так же,как в контролеТаким образом, исходя из результатов МТТтеста, для дальнейшего эксперимента по моделированию и оценке заживления раневого дефекта были выбраны матриксы в виде мембран, образованных ультратонкими волокнами, и пленки с коллагеновым покрытием.Оценка ранозаживляемости была выполнена на половозрелых крысахсамках с исходной массой 200220 г, с модельными дефектами кожных покровов. В эксперименте участвовало 3 группы животных (n=9 в группе); две экспериментальные с использованием полимерных пленок и мембран; контрольная группа –заживление дефекта без использования раневого покрытия, рана закрывалась стерильной марлевой повязкой. Животных содержали в виварии на стандартном рационе, руководствуясь инструкцией «Использование животных в космической биологии и медицине» Российского национального комитета по биоэтике Российской Академии наук, «Правилами проведения работ с экспериментальными животными», «Правилами по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению животных».Под ингаляционным наркозом в асептических условиях у каждого животного иссекали фрагмент кожи, включая эпидермис и дерму, до подкожножировой клетчатки, размером 15×15 мм в межлопаточной области. Экспериментальные раневые покрытия закрепляли 4 швами и закрывали стерильной марлевой повязкой.На 3, 7 и 10 сутки проводили отбор крови методом венесекции вены сафены для клинического анализа крови. Оценивали количество красных и белых клеток крови, гемоглобин, содержание зернистых лейкоцитовВ ходе эксперимента ежедневно проводили фотодокументирование ипланиметрию ран по методу Поповой с определением площади раневого дефекта.Развернутый анализ крови показал следующее: в лейкограмме у всех групп животных до 4го дня отмечена незначительная лимфопения, увеличение палочкоядерных нейтрофилов до 4%, сегментоядерных нейтрофилов до 1,2%. Через сутки после формирования дефекта отмечено снижение количества эритроцитов и гемоглобина с одновременным развитием лейкоцитоза. Восстановление количества эритроцитов и гемоглобина до исходной величины в экспериментальных группах зарегистрировано к третьему дню, а в контрольной–только к 7му. Изменения в показателях крови были нормальной реакцией в ответ на хирургическое вмешательство.Планиметрическая оценка ранозаживления показала, что наиболее удачным раневым покрытием было сочетание мембраны из ультратонких волокон с коллагеном. Хорошая газопроницаемость –одно из важнейших свойств раневых покрытий. Под пленкой на 5 сутки образовалось гнойное скопление, что связано с плохой газопроницаемостью пленки. При использовании ПГАмембраны с коллагеновым покрытием полное закрытие раны с восстановлением волосяного покрова произошло на 11 день, в группе ПГАпленки –на 13 день, в контроле –к концу эксперимента (14 сутки) наблюдался небольшой участок кожи размером 0,25 см2, восстановление волосяного покрова не произошло.

Рис. 2. Планиметрия ран при лечении раневыми покрытиями

на основе ПГА и коллагена.

Таким образом, наиболее эффективными раневыми покрытиями были комбинированные покрытия из мембраны, образованной ультратонкими волокнами, и коллагена.Завершая описание опытной работы, отметим, что полученные в ходе нее результаты подтвердили наше предположение об ускорении процесса регенерации поврежденных кожных тканейза счет нанесенияна ПГАматрикс специального белкового покрытия –коллагена.В дальнейшеммы планируем разработку практических рекомендаций по проведению клинических испытаний созданного раневого покрытия на основе ПГАматриксов. Ссылки на источники1. Яценко Я.О. Проблемы синтеза и производства биополимеров медицинского назначения// Полимеры в науке и технике.[Текст] : Всероссийская научная Интернетконференция с международным участием : материалы конф. (Казань, 10 июня 2014 г.) / Сервис виртуальных конференций Pax Grid ; сост. Синяев Д. Н.Казань : ИП Синяев Д. Н. , 2014.С. 8588.2.Волова Т.Г. и Шишацкая Е.И. Биоразрушаемые полимеры: синтез, свойства, применение. Монография. Красноярский писатель: Красноярск.2011.392 с.3. Вавилова Т.П. Биохимия тканей и жидкостей полости рта : учеб. пособие / Т.П. Вавилова. 2е изд., испр. и доп. М. : Издат.группа «ГЭОТАРМедиа», 2008. 208с.4. Биохимия: Учебник/ Под ред. Е.С. Северина.М.: ГЭОТАРМЕД, 2004.784 с.