Полный текст статьи
Печать

Метод клонального микроразмножения, основанный на уникальной способности растительной клетки к тотипотентности относится к приоритетным направлениям науки XXI века.

Использование данного метода базируется на множестве его преимуществ в сравнении с давно существующими традиционными способами размножения [1].

Методика культивирования изолированных меристем в настоящем практически разработана для более чем 2000 видов растений, в том числе и для плодово-ягодных культур [2].

Среди плодовых культур в России одной из ведущих является яблоня. В садоводстве продуктивность и долговечность современных яблоневых садов интенсивного типа определяется качеством посадочного материала. Включение метода клонального микроразмножения в систему производства оздоровленного посадочного материала позволяет соответствовать уровню мировых стандартов.

Метод клонального микроразмножения применяется как в питомниководстве, так и в селекционном процессе, поскольку за сравнительно короткий период он позволяет получать не только значительное количество однородного посадочного материала (ценные сорта, исходные формы, гибридный материал), но и параллельно оздоровить растения от патогенных микроорганизмов и в большинстве случаев от вирусов.

При получении корнесобственных растений метод микроразмножения позволяет ускоренно размножить генетически однородный материал с одновременным сокращением длительности ювенильной фазы [3].

У яблони in vitro наблюдается крайне низкий уровень сомаклональной изменчивости [4], что подтверждает эффективность метода клонального микроразмножения для данной культуры.

Известно, что используя метод микроклонального размножения, меристематические ткани можно культивировать в большом объеме в течении круглого года. Однако при размножении растений in vitro проявляются различия в регенерационной способности каждого генотипа. Порой данная особенность является лимитирующим фактором в размножении требуемого сорта [5, 6]. Для эффективного размножения каждого сорта необходим индивидуальный подбор сред.

Отсюда цель наших исследований – изучение пролиферативной активности сортов, обладающих абсолютной устойчивостью к парше (с геном Vf).

Этап собственно микроразмножения проводили с учетом опыта Н.И. Туровской [7].

Пролиферативная активность сортов изучалась на средах Murashige-Skoog [8] и И.М. Фардзиновой [9].

Для изучения процесса пролиферации использовали растительный материал сортов яблони Имрус, Болотовское, Юбиляр, полученный в условиях in vitro. Число стерильных эксплантов в каждом варианте 30.

Культивирование яблони проходило в условиях, общепринятых для культуры in vitro.

До настоящего времени в технологии микроклонального размножения яблони у исследователей приоритетной и наиболее универсальной считается питательная среда Murashige-Skoog [7. 10]. Использование нами данной среды (по прописи) не дало ожидаемого результата, регенерационная способность сортов яблони оказалась слишком низкой (коэффициент размножения был в пределах 1.0 – 1.2).

Модифицированный нами вариант среды MS, содержащий тройной объем хелата железа, РР – 0,5 мг/л, В6 – 0,1 мг/л, В1 – 0,4 мг/л, С – 1,5 мг/л, инозит – 0 мг/л, позволил повысить эффективность развития сортов (табл. 1).

Таблица 1

Коэффициент размножения сортов яблони на модифицированном варианте среды MS

Сорт

Имрус

Юбиляр

Искусственная питательная среда

MS – 1*

MS - 2

MS - 1

MS - 2

I пассаж

2,9±0,3

3,5±0,5

2,4±0,6

3,0±0,3

II пассаж

2,4±0,1

3,5±0,7

2,3±0,3

2,0±0,5

III пассаж

2,5±0,4

2,5±0,6

1,7±0,3

1,8±0,2

IV пассаж

1,5±0,2

1,4±0,7

1,4±0,1

1,5±0,6

 

*MS-1 – среда Murashige-Skoog + 6-БАП 1мг/л;

 MS-2 - среда Murashige-Skoog + 6-БАП 2мг/л.

Исследования показали, что у сортов Имрус и Юбиляр коэффициент размножения снижался от первого пассажа к четвертому. Тем не менее, среднее значение данного показателя было выше, чем на стандартной среде (MS – по прописи). Высота побегов сорта Имрус колебалась от 5 до 19 мм, а сорта Юбиляр - от 5 до 24 мм в зависимости от пассажа и концентрации цитокинина.

Процент побегов более 15 мм, то есть пригодных для укоренения, был в пределах 4,3 – 6,1 у сорта Имрус и 6,7 – 18,2 у сорта Юбиляр. Подобное развитие сортов яблони на этапе собственно микроразмножения свидетельствует лишь о способности сортов к развитию в условиях in vitro.

Для интенсивного пролиферирования яблони необходимо было найти условия, способствующие активному росту конгломератов.

Изучая практический опыт по культивированию in vitro многолетних плодовых культур было обращено внимание на исследования И.М. Фардзиновой [14] по культуре груши. Предлагаемая ею питательная среда позволила от единичного побега получить конгломераты из почек и побегов, количество которых достигало 40-45 единиц на один конгломерат.

Учитывая подобную результативность и необходимость поиска условий повышения пролиферативной активности сортов яблони, мы провели изучение этапа собственно микроразмножения яблони сорта Болотовское на средах MS и И.М. Фардзиновой.

Исследования показали, что развитие конгломератов данного сорта с большей активностью проходило на среде Ф (табл. 2).

Коэффициент размножения сорта Болотовское, который обеспечивала среда МS, не отличался ни высоким значением, ни стабильным изменением в сторону увеличения. Развитие конгломератов на среде Ф в разных ее модификациях способствовало более интенсивному пролиферированию сорта. При использовании сред Ф2 и Ф3 хотя и не наблюдалось постепенного увеличения коэффициента размножения сорта от первого пассажа к четвертому, тем не менее этот показатель был выше, чем на среде МS. 

Таблица 2

Пролиферативная активность яблони сорта Болотовское

Искусственная  питательная среда

МS – 1*

МS - 2

Ф - 2

Ф - 3

Ф - 4

Ф - 5

I пассаж

Коэффициент размножения

2,0±0,5

2,2±0,5

3,3±0,7

2,4±0,6

3,8±0,5

4,5±0,6

Средняя высота побега, мм

8,1±2,8

7,1±3,0

6,6±2,2

6,6±2,0

7,3±3,0

6,7±2,1

II пассаж

Коэффициент размножения

1,7±0,2

1,8±0,1

1,8±0,2

2,1±0,4

4,9±1,2

4,6±1,0

Средняя высота побега, мм

8,1±1,2

6,7±1,3

6,7±1,8

7,4±1,0

7,2±1,2

6,5±0,8

III пассаж

Коэффициент размножения

1,7±0,1

2,4±0,3

2,7±0,3

2,6±0,2

7,0±1,0

4,5±0,5

Средняя высота побега, мм

7,7±1,6

7,4±0,6

6,9±1,3

7,5±1,2

6,7±1,1

6,3±1,2

IV пассаж

Коэффициент размножения

1,8±0,1

2,4±0,3

3,5±0,2

2,5±0,3

5,4±1,0

3,9±0,2

Средняя высота побега, мм

7,0±1,7

7,5±1,6

7,0±1,0

9,2±2,8

5,9±1,1

5,3±0,7

 

* МS – 1 – среда МS + 1 мг/л 6-БАП;

МS – 2 – среда МS + 2 мг/л 6-БАП;

Ф – 2 – среда Ф с крайним наименьшим значением компонентов + 1 мг/л 6-БАП;

Ф – 3 – среда Ф с крайним наибольшим значением компонентов + 1 мг/л 6-БАП;

Ф – 4 – среда Ф с крайним наименьшим значением компонентов + 2 мг/л 6-БАП;

Ф – 5 – среда Ф с крайним наибольшим значением компонентов + 2 мг/л 6-БАП.

Степень пролиферации яблони на средах Ф – 4 и Ф – 5 была выше, чем на четырех предыдущих. Коэффициент размножения на среде Ф – 4 уже в третьем пассаже достигал 7. Среда Ф – 5 отличалась стабильным нарастанием почек и побегов на протяжении первых трех пассажей.

Средняя высота побегов не зависимо от среды и концентрации цитокинина не достигала требуемого значения для этапа ризогенеза. Только 12,5% побегов сорта Болотовское на среде Ф-3 имели высоту более 15 мм.

Использование на последнем этапе культивирования цитокинина 6-БАП в концентрации 0,1 мг/л способствовало вытягиванию побегов до высоты более 20 мм.

Следует отметить, что на всех средах Ф и по всем пассажам конгломераты почек и побегов имели здоровый вид и интенсивно зеленую окраску, отсутствовала витрификация и некроз тканей, которые можно было наблюдать на среде МS.

В целом на основании сравнительных результатов культивирования сорта на разных средах можно заключить, что для более успешного пролиферирования яблони сорта Болотовское целесообразнее использовать среду Ф, а ее модификацию – в зависимости от практической потребности в материале или направленности исследований.

Проведенные исследования свидетельствуют о целесообразности включения среды Ф в технологию микроразмножения яблони сорта Болотовское. Использование данной среды позволяет интенсифицировать этап собственно микроразмножения, повысив коэффициент размножения в среднем с 1,8 до 5,3, при этом не снизив качества конгломератов сорта Болотовское. Испытание среды Ф для других сортов будет дальнейшим этапом исследований.