Особенности микроклонального развития яблони с геном Vf и возможности индуцирования полиплоидных меристем в условиях in vitro
Международная
публикация
В.
Е. ДжафароваБиблиографическое описание статьи для цитирования:
Джафарова
В.
Е. Особенности микроклонального развития яблони с геном Vf и возможности индуцирования полиплоидных меристем в условиях in vitro // Научно-методический электронный журнал «Концепт». –
2013. – Т. 3. – С.
446–450. – URL:
http://e-koncept.ru/2013/53091.htm.
Аннотация. В статье обобщаются особенности двух этапов микроклонального размножения иммунных к парше сортов яблони. Оптимизация этапов введения и микроразмножения позволяет тиражировать сорта в виде почек и побегов (конгломераты). Отбор почек для колхицинирования позволил выявить лучшие варианты: адвентивные почки размером 3-4 мм и апикальные - до 5 мм. На основании изменения плоидности меристем в результате колхицинирования делается заключение о возможности индуцирования митотических полиплоидных
тканей сортов яблони с геном Vf.
Ключевые слова:
яблоня, in vitro, коэффициент размножения, колхицин, полиплоидные меристемы, триплоид
Текст статьи
Джафарова Валентина Егоровна,
кандидат сельскохозяйственных наук, заведующая лабораторией биотехнологии. Государственное научное учреждение Всероссийский НИИ селекции плодовых культур, г. Орел.saida.89@mail.ru
Особенности микроклонального развития яблони с геном Vfи возможности индуцирования полиплоидных меристем в условиях invitro
Аннотация. В статье обобщаются особенности двух этапов микроклонального размножения иммунных к парше сортов яблони. Оптимизация этапов введения и микроразмножения позволяеттиражировать сорта в виде почек и побегов (конгломераты). Отбор почек для колхицинирования позволил выявить лучшие варианты: адвентивные почки размером 34 мм и апикальные до 5 мм. На основании изменения плоидности меристем в результате колхицинированияделается заключение о возможности индуцирования митотических полиплоидных тканей сортов яблони с геном Vf.Ключевые слова:яблоня, invitro, коэффициент размножения, колхицин, полиплоидные меристемы, триплоид.
Наиболее культурный и полезный для человечества тип возделываемых растений –это полиплоидный тип. Эволюция культурных растений на основе полиплоидии обеспечивает всестороннее улучшение растений, повышение количества и качества продуктов и веществ, производимых данным видом растения. В подавляющембольшинстве случаев полиплоидные типы в этом отношении далеко оставляют позади себя свои исходные диплоидные формы [1].
Несмотря на то, что подавляющее большинство культивируемых сортов яблони –диплоиды (2n = 34), из полиплоидов основной хозяйственный интерес представляют триплоидные сорта (2n = 51). Данный факт обусловлен их биологическими и хозяйственными особенностями. Триплоидные сорта имеют: высокую и регулярную урожайность по годам [2, 3], отсутствие резко выраженной периодичности плодоношения [4],большую самоплодность [5] и устойчивость к болезням [6]. Плоды триплоидов по массе [4, 7] и содержанию витамина С превосходят диплоидные [3, 4].
Триплоидия у яблони, как отмечает Г.А. Бавтуто [8], наименьший уровень полиплоидии, который дает наибольший эффект. Ряд триплоидных сортов в настоящем представлен такими известными, как Болдуин, Пепин Ньютона, Ренет Кулона, Джонаголд, Витязь, Низкорослое, Мутсу, Спиголд, Зимнее превосходное, Память Семакину, Рождественское и многими другими.
Тетраплоидные формы яблони (2n = 68), как правило, не имеют хозяйственной ценности, но представляют интерес как исходный материал для селекции, так как наиболее эффективным способом массового получения триплоидов с целью последующего отбора среди них новых ценных сортов служат гетероплоидные скрещивания типа 2х Х 4х и 4х Х 2х [9].
Тетраплоидный уровень отмечен как у отдельных видов, так и у сортов яблони. Уже в 60е годы прошлого столетия спонтанные тетраплоиды были представлены обширным списком, среди которых клоны сортов Мелба, Спартан, Уэлси, Делишес, Голден Делишес, Папировка и многие другие [11].
Тетраплоидные формы яблони могут быть получены или выявлены не только в виде спортов известных сортов, в результате гибридизации, но и путем химического воздействия на растения.
Одним из наиболее эффективных полиплоидизирующих химических агентов признан алкалоид колхицин. Он обладает меньшей токсичностью и большой биологической активностью среди полиплоидизирующих веществ, вызывая даже ничтожными дозами (0,0006%) нарушения митозов и образование полиплоидных клеток и тканей [12]. Ранние исследования по воздействиюколхицином в разных концентрациях на сухие и наклюнувшиеся семена, проростки в разных фазах развития, точки роста взрослых растений указывали навозможности получения полиплоидных растений. В итоге были созданы колхиплоиды многих плодовых и ягодных культур (алыча, абрикос, персик, малина, земляника и другие), в том числе, яблони [13].
Ряд авторов [14, 15, 16],изучая индуцирование полиплоидов invitroу плодовых культур, отмечает, что воздействие химическими агентами необходимо осуществлять в момент деления наибольшего количества клеток, поскольку полиплоидия возникает в результате разделения хромосом, не сопровождающегося общим делением клетки. Для этих целей больше всего подходит меристема, количественный показатель которой обеспечивается методом микроклонального размножения.
Для получения гибридов лука с полиплоидным уровнем И.Я. Марьяхиной с соавторами [17] предложен универсальный метод полиплоидизации. Эффективность метода определяется тем, что в условиях культуры ткани (invitro) колхицином обрабатываются не готовые, сформировавшиеся побеги или растения, как это имеет место invivo, а ткани, содержащие меристематические зоны. В этом случае полиплоидизируются инициальные клетки, которые дают начало новым растениям, что резко повышает в них содержание полиплоидных клеток. Эффективность колхицинирования invitroдополнительно обеспечивается введением в среду стимуляторов роста, способствующих увеличению пролиферативной активности меристематических зон, а значит, выходу полиплоидных регенерантов. Успех колхицинирования invitroопределяется высокой выживаемостью широкого спектра генетически измененных форм, за счет стерильных условий и искусственной питательной среды.
Селекция яблони на полиплоидном уровне ранее велась во многих регионах нашей страны и странах ближнего зарубежья. Полиплоидия,как метод в селекции,в настоящее время практически используется только в ГНУ ВНИИСПК Россельхозакадемии, где ведется планомерная, крупномасштабная селекционная работа по яблоне. До определенного времени здесь была создана самая большаяколлекция полиплоидных форм —доноров диплоидных гамет [18]. Существенным недостатком имеющейся коллекции доноров диплоидных гамет являлось и является отсутствие среди них форм,иммунных к парше. Этот недостаток можно исключитьподбором второго компонента для гетероплоидных скрещиваний: иммунные сорта или формы. В этом случае триплоидное гибридное потомство из трех геномов один получает от иммунной формы. При наличии иммунных доноров диплоидных гамет было бы более надежным получение иммунных триплоидных сортов с двойным геномом устойчивости. В силу ряда причин общее количество тетраплоидов используемых в селекции в последние годы стало значительно меньше. Следовательно, проблема, существующая ранее –ограниченный набор исходных формдоноров диплоидных гамет –остается и в настоящее время. Необходимо увеличить количество гомогенных тетраплоидных форм и, возможно, диплоиднотетраплоидных химер. Важно при этом, чтобы второй гистогенный слой апикальных меристем точек роста химер яблони, отвечающий за формирование генетической ткани был тетраплоидным (подэпидральный слой 4х). Только в том случае, если подэпидермальный слой тетраплоидный, диплоидно –тетраплоидная химера ведет себя в селекции как настоящий тетраплоид и в гибридном потомстве при скрещивании с диплоидными сортами образует триплоидные растения.
Результативность метода полиплоидизации овощных культур [19], который позволяет обеспечить выход полиплоидов на 80 –100% и положительные особенности метода культуры тканей, а также необходимость индуцирования тетраплоидных форм от диплоидных иммунных сортов послужили основанием для разработки метода полиплоидизации invitroмеристематических тканей яблони с геном Vfс целью увеличения тетраплоидных растений, как доноров диплоидных гамет, необходимых для получения триплоидов. Использование полиплоидии с целью получения триплоидных сортов остается важным и несомненно актуальным в селекции яблони.
В начале разработки метода необходимо было выявить возможности сортов яблони, иммунных к парше, к размножению в условиях in vitro.
В исследования были включены четыре сорта яблони: Болотовское, Имрус, Солнышко, Памяти Хитрово носители гена Vf(иммунитета к парше).
Этапы микроклонального размножения яблони проводили с учетом методов Калинина Ф.Л., Сарнацкой В.В. И Полищук В.Е. [20]
Для регенерации из эксплантов и размножения микропобегов яблони использовали искусственную питательную среду Мурасиге —Скуга (МС).
Исследования выполнялись только на двух этапах: 1) введение эксплантов яблони в стерильную культуру; 2) собственно микроразмножение. Укоренение микропобегов, как этап микроразмножения, был исключен, в связи с тем, что для полиплоидизации необходимы меристематические ткани.
Введение меристем яблони в культуру, основанное на однотипных рекомендациях Ф.Л. Калинина, В.В. Сарнацкой, В.Е. Полищук [20], О.А. Леонтьева –Орлова [21], Н.И. Туровской [22], не позволило успешно провести этот этап. Приживаемость меристем достигала всего лишь 27%. Меристемы погибали от недостаточной стерилизации и в большей степени от окисления. Сразу после посадки меристем на среду продукты окисления фенолов вызывали пожелтение, а затем некроз ткани. Использование на последней ступени стерилизации антиоксидантной смеси по рекомендации Г.П. Атрощенко с соавторами [23] повысило процент выживания эксплантов яблони всего лишь до 56%.
Меристемы, прижившиеся и получившие развитие, в дальнейшем от пассажа к пассажу погибали от витрификации. Поэтому, для повышения результативности этапа введения в культуру испытывались различные стерилизующие агенты и их концентрации, время стерилизации, типы вводимого материала, изменение концентрации аммонийной формы азота.
В качестве стерилизующих агентов были использованы смесь 3% перекиси водорода и 96%ного спирта (1:1) с последующей обработкой сулемой 0,1%; мертиолят 0,01% и 0,1%; смесь коммерческого препарата ''Белизна'' с водой (1:4). Стерилизацию проводили поэтапно: 1) промывка эксплантов под проточной водой; 2) обработка спиртом (57 сек); 3) промывка стерильной водой 10 мин; 4) обработка стерилизующим агентом 510 мин; 5) промывка в стерильной воде 3х кратная по 10 минут. К стерилизующим агентам добавляли одну каплю твин20. В среднем процент заражения в зависимости от сорта колебался от 10 до 62. Самый высокий процент заражения у сортов отмечен при обработке смесью белизны с водой (1:4) и 0,01% раствором мертиолята в течении 5 мин. Наилучший вариант среди испытанных для стерилизации исходного материала –0,1% раствор мертиолята в течении 10 минут с добавлением капли твин20.
Введение разных типов исходного материала показало, что лучше всего приживаются микропобеги и этиолированные микропобеги высотой 57 мм. Приживаемость такого материала составила от 68% у сорта Болотовское до 90% у других испытанных сортов.
Окисление верхушечной культивируемой ткани за счет активизирования ферментов, окисляющих фенолы, происходило у всех типов эксплантов (меристема, микропобеги, этиолированные меристема и микропобеги) и у всех сортов, но в разной степени. Гибель только от окисления меристем достигала от 36,0% до 52,6% в зависимости от сорта. Если учесть недостаточную степень стерилизации и не устранить негативное влияние фенолов, то гибель меристем может достигать от 63 до 97%.
Известно, что фенольные соединения являются критерием устойчивости растений, т.е. по логике у иммунных сортов их должно быть больше, чем у неиммунных.
Учитывая негативное влияние фенолов на этапе введения, была выдвинута рабочая гипотеза о прямой зависимости приживаемости меристем от количества фенольных соединений (чем ихбольше, тем сильнее будет происходить процесс окисления, тем хуже приживаемость).
Анализ на содержание Рактивных веществ в вегетативных почках яблони показал, что не существует прямой зависимости приживаемости исходного материала от количества фенольных соединений. Приживаемость меристем зависит от степени и продолжительности окисления фенолов.
Самое сильное окисление меристем за годы исследований проявлялось у сорта Болотовское, слабее у других сортов. У неиммунного сорта Орловим отмечено также окисление меристем, но в очень слабой степени, не смотря на то, что по сумме Рактивных веществ он превосходит сорт Болотовское (табл. 1).Таблица 1Содержание Рактивныхвеществ в вегетативных почках яблони(мг % на 100 г вещества)
Сорт 2005 г.2006 г.Рактивные веществаСумма Рактив. ввРактивные веществаСумма Рактив. ввКатехиныЛейкоантоцианыКатехиныЛейкоантоцианыАнтоцианыИмрус 296,832,9329,7281,262,589,3433,0Болотовское360,084,2444,2397,880,448,2526,4Солнышко 646,0275,9921,9615,10,043,4658,5Памяти Хитрово604,0107,6711,6438,30,030,0468,3Орловим (неиммунный)469,5133,7603,2373,40,043,8417,2
Снять негативное действие фенолов после введения эксплантов в культуру стало возможным пересадкой их на свежую среду в пределах 5 —24 часов с момента введения. Меристемы сорта Имрус были пересажены трижды, других сортов —дважды.
Полное присутствие азотсодержащих солей KNO3и NH4NO3вызывало ненормальное разрастание и сильное обводнение тканей, то есть витрификацию. Аммонийная форма азота среды МС при введении меристем в культуру,в первом и втором пассажах была уменьшена в 4 раза. Начиная с третьего пассажа и далее пролиферация побегов проходила на той же среде, но содержание аммонийной формы азота было уменьшено в 2 раза. Доза хелата железа (двойная, тройная) варьировала в зависимости от интенсивности окраски конгломератов. Мезоинозит был полностью исключен из состава среды, так какдобавление даже десятой доли его в среду вызывало рост каллуса и полное зарастание не только меристем, но и единичных побегов высотой до 8 мм.
Экспланты, высаженные на среду с концентрацией 6бензиламинопурина (6БАП)–0,5 мг/л, выдерживали в термостате 3 суток при температуре 180С. Затем экспланты культивировали при t–2426 0С, влажности воздуха 7075% и освещенности 2,53,0 тыс. люкс. Через 7 дней экспланты пересаживали на свежую среду.
Для массового размножения яблони испытывали концентрации БАП 1, 2 и 3 мг/л. При концентрации цитокинина 1 мг/л коэффициент размножения был невелик –1,41,7 в зависимости от сорта. При использовании БАП 2 и 3 мг/л коэффициент размножения существенно не различался и составлял у сорта Болотовское –2,7; Имрус –2,2; Памяти Хитрово и Солнышко –2,0. Однако при концентрации БАП –2 мг/л отмечен рост побегов в длину.
Поиск концентрации ГК с целью элонгации побегов для отработки качественного показателя почек на предмет полиплоидизации не дал результатов. Испытывались концентрации 1, 2, 3, 4, 5 мгна 1 литрсреды на фоне БАП –2 мг/л. Снижение концентрации БАП с 2 мг/л до 0,5 и 0,3 мг/л без ГК, также не способствовало вытягиванию побегов. Полученные данные двух этапов микроразмножения позволяют говорить о способности иммунных сортов яблони к размножению в условиях in vitro, что дает возможность тиражироватьисходный материал для полиплоидизации тканей.
Для колхицинирования меристем необходимо было определить качественный показатель почек, тоесть размер и расположение их в конгломерате. В результате подбора почек, который проводился на сорте Болотовское, из пяти вариантов: 1.почки (аксилярные) в пазухах листьев размером до 1 мм;2.почки в пазухах листьев размером в 1 мм с кольцом побега, шириной2 мм;3.почки 2 мм;4.адвентивные почки 34 мм;5.апикальные почки до 5 ммпо приживаемости после их вычленения и обработки колхицином выгодно отличались адвентивные почки размером до 34 мм, выросшие у основания конгломерата и апикальные почки до 5 мм. Приживаемость таких почек варьировала от 63 до 100%. Аксилярные почки до 1 мм погибали через неделю в силу давления на них при вычленении и от некроза. Почки с кольцом побега шириной в 2 мм дали низкий процент приживаемости (10%). В дальнейшем целесообразно было использование только 4 и 5 вариантов почек.
Колхицином обрабатывали почки сортов Болотовское и Имрус, выросшие in vitro, капельным способом (концентрация колхицина 0,05%; 0,1%; 0,2%; время обработки 24, 48, 72 часа), а также почки, пассированные на среду, содержащую колхицин в концентрации 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05% при той же временной экспозиции. Обработанные почки после экспозиции подвергались промыванию стерильной водой.
Важно отметить, что приживаемость промытых почек находилась в пределах 63,3 100%, без промывания —10,0 23,3 %. Очевидно процесс промывания позволяет не только убрать последействие полиплоидизирующего агента, но и уменьшить некротизацию обработанных тканей. После колхицинирования почки пересаживали на среду размножения, содержащую БАП в концентрации 2 мг/л среды, где наблюдалось замедленное развитие почек до конгомератов, а в последующих пассажах отсутствие вытягивания побегов. Дополнительное внесение в среду 1 мг/л ГК не повлияло на элонгацию побегов (Рис.1).
Микроразмножение колхицинированных почек яблони
а) сорт Болотовское б) сорт Имрус
За 4 пассажа микроразмножения максимальная высота побегов не превышала 10 мм. В данном случае возможно предположить не только ингибирующее действие колхицина на развитие почек, но и недостаточную концентрацию ГК. В последующих пассажах развитие конгломератов проходило в режиме не обработанных тканей, то есть увеличивалось образование почек и побегов, а линейный рост побегов был в норме.
Проведенные цитологические анализы в лаборатории цитоэмбриологии и генетики ВНИИСПК под руководством доктора с.х. наук Г.А. Седышевой выявили повышение плоидности обработанных тканей яблони. При капельном способе обработки точек роста сорта Болотовское колхицином в концентрации 0,2% в режиме 72 часов и Имрус при той же концентрации алкалоида, но в режиме 24 часов отмечены меристемы с триплоидным набором хромосом. С тетраплоидным набором хромосом полученымеристемы сорта Болотовское, обработанные 0,1% раствором колхицина и выдержанные 48 часов, а также меристемысорта Имрус при временной экспозиции 72 часа и концентрации колхицина 0,2%.Добавление колхицина в среду вызвало изменение плоидности точек роста у сорта Имрус при концентрации колхицина 0,01% и экспозиции в 24 часа. Причем,в этом варианте получены и тетраплоидные и триплоидные меристемы, но последних больше.У сорта Болотовское при этой же концентрации колхицина, но временной экспозиции48 часов отмечено наличие химерных тканей. Неравнозначное изменение плоидности меристемных тканей яблони,вероятно,связано с разной их чувствительностью к полиплоидизирующему агенту и диффундированием колхицина в делящиеся клетки или же степенью интенсивности клеточного деления в период воздействия колхицином.
Сравнивая оба способа полиплоидизации, более производительным предварительно можно считать капельный, поскольку при данномспособе обработки было выявлено индуцирование большего количества полиплоидных меристем.
Данные исследования свидетельствуют о сложностии в тоже время возможности реализации процессов регенерации сортов яблони in vitro. Оптимизация условий на этапах введения и микроразмножения позволяет тиражировать меристему яблони. Концентрация 6БАП в среде 2 мг/л определяет оптимальный коэффициент размножения. Для стабильности этого процесса необходимо учитывать все выше изложенные нюансы.
Возможности индукции полиплоидизации меристематических тканей яблони с геном Vfв условиях in vitro зафиксировано цитологическими исследованиями.
Получение полноценных растений с обязательным цитологическим анализом на плоидность каждого будет являться заключительным этапом данной разработки в условиях in vitro.
Ссылки на источники1.Жуковский П.М. Эволюция культурных растений на основе полиплоидии. В трудах: Полиплоидия и селекция. М.Л. Издво ''Наука'', 1965. С. 517.2.Туз А.С. Полиплоидия у плодовых культур. Вестник с.х. науки, 1965. №6. С. 1721.3.Лозицкий А.Я. Биологическая и хозяйственная характеристика полиплоидных сортов яблони и груши. Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук —Л., 1970. 20 с.4.Исаев С.И., Домрачева И.И. Использование полиплоидии в селекции яблони. В сборнике: Селекция яблони в СССР. Орел., 1981. С. 179 —185.5.Haskell G. Man, poliploidy and fruit tree growing in Britain. Evolution, N.J., 1955. P. 291 —301.6.Седов Е.Н., Седышева Г.А., Жданов В.В. Состояние и перспективы селекции яблони на полиплоидном уровне. В сборнике: Селекция яблони на улучшение качества плодов. Орел, 1985. С. 169 —178.7.Пономаренко В.В. Полиплоидия видов рода Malus Mill. В сб.: Селекция яблони на улучшение качества плодов. Орел, ВАСХНИЛ, 1985. С. 163 —168.8.Бавтуто Г.А. Экспериментальная автополиплоидия у яблони (Malus Mill). Тезисы докладов: Генетика и селекция растений. Л., 1977. С. 39 —40.9.Седов Е.Н. Значение и задачи селекции в улучшении сортимента и интенсификации производства плодов. В сб.: Селекция и сорторазведение садовых культур. Орел., 1992. С. 18 —35.10.Седышева Г.А. Полиплоидия и селекция яблони. В сб.: Селекция яблони в СССР. Орел., 1981. С. 192 —198.11.A Survey of Apple Clones in the United States. Agrecultural Research Service. U.S. Department of Agreculture., 1963. Р. 324.12.Кольцова Н.К. К методике искусственного вызывания полиплоидии колхицином. Докл. АН СССР, 1939. Т. 23. №5. С. 481 —484.13.Nebel B.R. Inducing changes in planets with colchicine shows progress Fm. Res. N. Y., 1940. V. 6. P. 10 —15.14.Щербаков В.К. Методы экспериментального получения полиплоидов у растений. Труды МОИП: Полиплоидия у растений. М., 1962. T. V. С. 110 —120.15.Терновский М.Ф. Преодоление бесплодия у межвидовых гибридов Nicotiana. В сб.: Полиплоидия и селекция. М. Л., издво ''Наука'', 1965. С. 70 —80.16.Рыбин В.А. Цитологический метод в селекции плодовых. М., ''Колос'', 1967. 216 с.17.Марьяхина И.Я., Полумордвинова И.В., Кокорева В.А., Луконина С.И. Биотехнология получения фертильных форм межвидовых гибридов лука на основе полиплоидизации in vitro. В сб.: Состояние и перспективы развития с. х. биотехнологии. М., 1986. С. 86 —91.18.Седышева Г.А., Седов Е.Н. Эффективность использования полиплоидии в создании адаптивных сортов яблони. В сб.: Роль сортов и новых технологий в интенсовном садоводстве. Орел., издво ГНУ ВНИИСПК, 2003. С. 323 —325.19.Марьяхина И.Я., Полумордвинова И.В., Московкин Л.И., Шевченко Г.С. Полиплоидизация in vitro основа для разработки биотехнологий в селекции лука и чеснока. Тезисы докладов V съезда ВОГИС, 1987. Т. IV. Ч. 4. С. 73 —74.20.Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии. Киев, 1980. 240 с.21.Леонтьев –ОрловО.А., ТрушечкинВ.Г., ВысоцкийВ.А..В сб.:Особенности культивирования изолированных апексов яблони invitro. Плодоводство в Нечерноземной полосе. –М., 1988. –С. 2130.22.Туровская Н.И. Микроразмножение яблони и груши invitro.Садоводство и виноградарство. –1994.№1. С. 10.23.Атрощенко Г.П., Самохин Г.М., ОрловаС.Ю.В сб.:Применение антиоксидантов в биотехнологии плодовых и ягодных культур. Использование биотехнологических методов для решения генетико –селекционных проблем. –Мичуринск, 1998. С. 2528.
DzhafarovaValentinaCandidateofagriculturalsciences, biotechnologylaboratoryhead.StateScientificInstitutionAllRussian Research Institute of Fruit Crop Breeding, Orel.Peculiarities of micro clonal propagation of apple with gene Vfand possibilities of inducing of polyploidy meristems in vitro.Abstract. The peculiarities of two stages of the micro clonal propagation of scab immune apple varieties are generalized in this paper. The optimization of the stages of meristems planting in the media and micro propagation allows copying varieties in a kind of buds and shoots (conglomerates).The selection of buds for colchicine treatment allows revealing the best variants: adventive buds at 34 mm size and apical buds up to 5 mm size.On the ground of meristem ploidy change as a result of the colchicine treatment it is concluded that there is a possibility to induce mitotic polyploidy tissues of apple varieties with gene Vf.Key words: apple, in vitro, propagation coefficient, colchicine, polyploidy meristems, triploid, tetraploid.
кандидат сельскохозяйственных наук, заведующая лабораторией биотехнологии. Государственное научное учреждение Всероссийский НИИ селекции плодовых культур, г. Орел.saida.89@mail.ru
Особенности микроклонального развития яблони с геном Vfи возможности индуцирования полиплоидных меристем в условиях invitro
Аннотация. В статье обобщаются особенности двух этапов микроклонального размножения иммунных к парше сортов яблони. Оптимизация этапов введения и микроразмножения позволяеттиражировать сорта в виде почек и побегов (конгломераты). Отбор почек для колхицинирования позволил выявить лучшие варианты: адвентивные почки размером 34 мм и апикальные до 5 мм. На основании изменения плоидности меристем в результате колхицинированияделается заключение о возможности индуцирования митотических полиплоидных тканей сортов яблони с геном Vf.Ключевые слова:яблоня, invitro, коэффициент размножения, колхицин, полиплоидные меристемы, триплоид.
Наиболее культурный и полезный для человечества тип возделываемых растений –это полиплоидный тип. Эволюция культурных растений на основе полиплоидии обеспечивает всестороннее улучшение растений, повышение количества и качества продуктов и веществ, производимых данным видом растения. В подавляющембольшинстве случаев полиплоидные типы в этом отношении далеко оставляют позади себя свои исходные диплоидные формы [1].
Несмотря на то, что подавляющее большинство культивируемых сортов яблони –диплоиды (2n = 34), из полиплоидов основной хозяйственный интерес представляют триплоидные сорта (2n = 51). Данный факт обусловлен их биологическими и хозяйственными особенностями. Триплоидные сорта имеют: высокую и регулярную урожайность по годам [2, 3], отсутствие резко выраженной периодичности плодоношения [4],большую самоплодность [5] и устойчивость к болезням [6]. Плоды триплоидов по массе [4, 7] и содержанию витамина С превосходят диплоидные [3, 4].
Триплоидия у яблони, как отмечает Г.А. Бавтуто [8], наименьший уровень полиплоидии, который дает наибольший эффект. Ряд триплоидных сортов в настоящем представлен такими известными, как Болдуин, Пепин Ньютона, Ренет Кулона, Джонаголд, Витязь, Низкорослое, Мутсу, Спиголд, Зимнее превосходное, Память Семакину, Рождественское и многими другими.
Тетраплоидные формы яблони (2n = 68), как правило, не имеют хозяйственной ценности, но представляют интерес как исходный материал для селекции, так как наиболее эффективным способом массового получения триплоидов с целью последующего отбора среди них новых ценных сортов служат гетероплоидные скрещивания типа 2х Х 4х и 4х Х 2х [9].
Тетраплоидный уровень отмечен как у отдельных видов, так и у сортов яблони. Уже в 60е годы прошлого столетия спонтанные тетраплоиды были представлены обширным списком, среди которых клоны сортов Мелба, Спартан, Уэлси, Делишес, Голден Делишес, Папировка и многие другие [11].
Тетраплоидные формы яблони могут быть получены или выявлены не только в виде спортов известных сортов, в результате гибридизации, но и путем химического воздействия на растения.
Одним из наиболее эффективных полиплоидизирующих химических агентов признан алкалоид колхицин. Он обладает меньшей токсичностью и большой биологической активностью среди полиплоидизирующих веществ, вызывая даже ничтожными дозами (0,0006%) нарушения митозов и образование полиплоидных клеток и тканей [12]. Ранние исследования по воздействиюколхицином в разных концентрациях на сухие и наклюнувшиеся семена, проростки в разных фазах развития, точки роста взрослых растений указывали навозможности получения полиплоидных растений. В итоге были созданы колхиплоиды многих плодовых и ягодных культур (алыча, абрикос, персик, малина, земляника и другие), в том числе, яблони [13].
Ряд авторов [14, 15, 16],изучая индуцирование полиплоидов invitroу плодовых культур, отмечает, что воздействие химическими агентами необходимо осуществлять в момент деления наибольшего количества клеток, поскольку полиплоидия возникает в результате разделения хромосом, не сопровождающегося общим делением клетки. Для этих целей больше всего подходит меристема, количественный показатель которой обеспечивается методом микроклонального размножения.
Для получения гибридов лука с полиплоидным уровнем И.Я. Марьяхиной с соавторами [17] предложен универсальный метод полиплоидизации. Эффективность метода определяется тем, что в условиях культуры ткани (invitro) колхицином обрабатываются не готовые, сформировавшиеся побеги или растения, как это имеет место invivo, а ткани, содержащие меристематические зоны. В этом случае полиплоидизируются инициальные клетки, которые дают начало новым растениям, что резко повышает в них содержание полиплоидных клеток. Эффективность колхицинирования invitroдополнительно обеспечивается введением в среду стимуляторов роста, способствующих увеличению пролиферативной активности меристематических зон, а значит, выходу полиплоидных регенерантов. Успех колхицинирования invitroопределяется высокой выживаемостью широкого спектра генетически измененных форм, за счет стерильных условий и искусственной питательной среды.
Селекция яблони на полиплоидном уровне ранее велась во многих регионах нашей страны и странах ближнего зарубежья. Полиплоидия,как метод в селекции,в настоящее время практически используется только в ГНУ ВНИИСПК Россельхозакадемии, где ведется планомерная, крупномасштабная селекционная работа по яблоне. До определенного времени здесь была создана самая большаяколлекция полиплоидных форм —доноров диплоидных гамет [18]. Существенным недостатком имеющейся коллекции доноров диплоидных гамет являлось и является отсутствие среди них форм,иммунных к парше. Этот недостаток можно исключитьподбором второго компонента для гетероплоидных скрещиваний: иммунные сорта или формы. В этом случае триплоидное гибридное потомство из трех геномов один получает от иммунной формы. При наличии иммунных доноров диплоидных гамет было бы более надежным получение иммунных триплоидных сортов с двойным геномом устойчивости. В силу ряда причин общее количество тетраплоидов используемых в селекции в последние годы стало значительно меньше. Следовательно, проблема, существующая ранее –ограниченный набор исходных формдоноров диплоидных гамет –остается и в настоящее время. Необходимо увеличить количество гомогенных тетраплоидных форм и, возможно, диплоиднотетраплоидных химер. Важно при этом, чтобы второй гистогенный слой апикальных меристем точек роста химер яблони, отвечающий за формирование генетической ткани был тетраплоидным (подэпидральный слой 4х). Только в том случае, если подэпидермальный слой тетраплоидный, диплоидно –тетраплоидная химера ведет себя в селекции как настоящий тетраплоид и в гибридном потомстве при скрещивании с диплоидными сортами образует триплоидные растения.
Результативность метода полиплоидизации овощных культур [19], который позволяет обеспечить выход полиплоидов на 80 –100% и положительные особенности метода культуры тканей, а также необходимость индуцирования тетраплоидных форм от диплоидных иммунных сортов послужили основанием для разработки метода полиплоидизации invitroмеристематических тканей яблони с геном Vfс целью увеличения тетраплоидных растений, как доноров диплоидных гамет, необходимых для получения триплоидов. Использование полиплоидии с целью получения триплоидных сортов остается важным и несомненно актуальным в селекции яблони.
В начале разработки метода необходимо было выявить возможности сортов яблони, иммунных к парше, к размножению в условиях in vitro.
В исследования были включены четыре сорта яблони: Болотовское, Имрус, Солнышко, Памяти Хитрово носители гена Vf(иммунитета к парше).
Этапы микроклонального размножения яблони проводили с учетом методов Калинина Ф.Л., Сарнацкой В.В. И Полищук В.Е. [20]
Для регенерации из эксплантов и размножения микропобегов яблони использовали искусственную питательную среду Мурасиге —Скуга (МС).
Исследования выполнялись только на двух этапах: 1) введение эксплантов яблони в стерильную культуру; 2) собственно микроразмножение. Укоренение микропобегов, как этап микроразмножения, был исключен, в связи с тем, что для полиплоидизации необходимы меристематические ткани.
Введение меристем яблони в культуру, основанное на однотипных рекомендациях Ф.Л. Калинина, В.В. Сарнацкой, В.Е. Полищук [20], О.А. Леонтьева –Орлова [21], Н.И. Туровской [22], не позволило успешно провести этот этап. Приживаемость меристем достигала всего лишь 27%. Меристемы погибали от недостаточной стерилизации и в большей степени от окисления. Сразу после посадки меристем на среду продукты окисления фенолов вызывали пожелтение, а затем некроз ткани. Использование на последней ступени стерилизации антиоксидантной смеси по рекомендации Г.П. Атрощенко с соавторами [23] повысило процент выживания эксплантов яблони всего лишь до 56%.
Меристемы, прижившиеся и получившие развитие, в дальнейшем от пассажа к пассажу погибали от витрификации. Поэтому, для повышения результативности этапа введения в культуру испытывались различные стерилизующие агенты и их концентрации, время стерилизации, типы вводимого материала, изменение концентрации аммонийной формы азота.
В качестве стерилизующих агентов были использованы смесь 3% перекиси водорода и 96%ного спирта (1:1) с последующей обработкой сулемой 0,1%; мертиолят 0,01% и 0,1%; смесь коммерческого препарата ''Белизна'' с водой (1:4). Стерилизацию проводили поэтапно: 1) промывка эксплантов под проточной водой; 2) обработка спиртом (57 сек); 3) промывка стерильной водой 10 мин; 4) обработка стерилизующим агентом 510 мин; 5) промывка в стерильной воде 3х кратная по 10 минут. К стерилизующим агентам добавляли одну каплю твин20. В среднем процент заражения в зависимости от сорта колебался от 10 до 62. Самый высокий процент заражения у сортов отмечен при обработке смесью белизны с водой (1:4) и 0,01% раствором мертиолята в течении 5 мин. Наилучший вариант среди испытанных для стерилизации исходного материала –0,1% раствор мертиолята в течении 10 минут с добавлением капли твин20.
Введение разных типов исходного материала показало, что лучше всего приживаются микропобеги и этиолированные микропобеги высотой 57 мм. Приживаемость такого материала составила от 68% у сорта Болотовское до 90% у других испытанных сортов.
Окисление верхушечной культивируемой ткани за счет активизирования ферментов, окисляющих фенолы, происходило у всех типов эксплантов (меристема, микропобеги, этиолированные меристема и микропобеги) и у всех сортов, но в разной степени. Гибель только от окисления меристем достигала от 36,0% до 52,6% в зависимости от сорта. Если учесть недостаточную степень стерилизации и не устранить негативное влияние фенолов, то гибель меристем может достигать от 63 до 97%.
Известно, что фенольные соединения являются критерием устойчивости растений, т.е. по логике у иммунных сортов их должно быть больше, чем у неиммунных.
Учитывая негативное влияние фенолов на этапе введения, была выдвинута рабочая гипотеза о прямой зависимости приживаемости меристем от количества фенольных соединений (чем ихбольше, тем сильнее будет происходить процесс окисления, тем хуже приживаемость).
Анализ на содержание Рактивных веществ в вегетативных почках яблони показал, что не существует прямой зависимости приживаемости исходного материала от количества фенольных соединений. Приживаемость меристем зависит от степени и продолжительности окисления фенолов.
Самое сильное окисление меристем за годы исследований проявлялось у сорта Болотовское, слабее у других сортов. У неиммунного сорта Орловим отмечено также окисление меристем, но в очень слабой степени, не смотря на то, что по сумме Рактивных веществ он превосходит сорт Болотовское (табл. 1).Таблица 1Содержание Рактивныхвеществ в вегетативных почках яблони(мг % на 100 г вещества)
Сорт 2005 г.2006 г.Рактивные веществаСумма Рактив. ввРактивные веществаСумма Рактив. ввКатехиныЛейкоантоцианыКатехиныЛейкоантоцианыАнтоцианыИмрус 296,832,9329,7281,262,589,3433,0Болотовское360,084,2444,2397,880,448,2526,4Солнышко 646,0275,9921,9615,10,043,4658,5Памяти Хитрово604,0107,6711,6438,30,030,0468,3Орловим (неиммунный)469,5133,7603,2373,40,043,8417,2
Снять негативное действие фенолов после введения эксплантов в культуру стало возможным пересадкой их на свежую среду в пределах 5 —24 часов с момента введения. Меристемы сорта Имрус были пересажены трижды, других сортов —дважды.
Полное присутствие азотсодержащих солей KNO3и NH4NO3вызывало ненормальное разрастание и сильное обводнение тканей, то есть витрификацию. Аммонийная форма азота среды МС при введении меристем в культуру,в первом и втором пассажах была уменьшена в 4 раза. Начиная с третьего пассажа и далее пролиферация побегов проходила на той же среде, но содержание аммонийной формы азота было уменьшено в 2 раза. Доза хелата железа (двойная, тройная) варьировала в зависимости от интенсивности окраски конгломератов. Мезоинозит был полностью исключен из состава среды, так какдобавление даже десятой доли его в среду вызывало рост каллуса и полное зарастание не только меристем, но и единичных побегов высотой до 8 мм.
Экспланты, высаженные на среду с концентрацией 6бензиламинопурина (6БАП)–0,5 мг/л, выдерживали в термостате 3 суток при температуре 180С. Затем экспланты культивировали при t–2426 0С, влажности воздуха 7075% и освещенности 2,53,0 тыс. люкс. Через 7 дней экспланты пересаживали на свежую среду.
Для массового размножения яблони испытывали концентрации БАП 1, 2 и 3 мг/л. При концентрации цитокинина 1 мг/л коэффициент размножения был невелик –1,41,7 в зависимости от сорта. При использовании БАП 2 и 3 мг/л коэффициент размножения существенно не различался и составлял у сорта Болотовское –2,7; Имрус –2,2; Памяти Хитрово и Солнышко –2,0. Однако при концентрации БАП –2 мг/л отмечен рост побегов в длину.
Поиск концентрации ГК с целью элонгации побегов для отработки качественного показателя почек на предмет полиплоидизации не дал результатов. Испытывались концентрации 1, 2, 3, 4, 5 мгна 1 литрсреды на фоне БАП –2 мг/л. Снижение концентрации БАП с 2 мг/л до 0,5 и 0,3 мг/л без ГК, также не способствовало вытягиванию побегов. Полученные данные двух этапов микроразмножения позволяют говорить о способности иммунных сортов яблони к размножению в условиях in vitro, что дает возможность тиражироватьисходный материал для полиплоидизации тканей.
Для колхицинирования меристем необходимо было определить качественный показатель почек, тоесть размер и расположение их в конгломерате. В результате подбора почек, который проводился на сорте Болотовское, из пяти вариантов: 1.почки (аксилярные) в пазухах листьев размером до 1 мм;2.почки в пазухах листьев размером в 1 мм с кольцом побега, шириной2 мм;3.почки 2 мм;4.адвентивные почки 34 мм;5.апикальные почки до 5 ммпо приживаемости после их вычленения и обработки колхицином выгодно отличались адвентивные почки размером до 34 мм, выросшие у основания конгломерата и апикальные почки до 5 мм. Приживаемость таких почек варьировала от 63 до 100%. Аксилярные почки до 1 мм погибали через неделю в силу давления на них при вычленении и от некроза. Почки с кольцом побега шириной в 2 мм дали низкий процент приживаемости (10%). В дальнейшем целесообразно было использование только 4 и 5 вариантов почек.
Колхицином обрабатывали почки сортов Болотовское и Имрус, выросшие in vitro, капельным способом (концентрация колхицина 0,05%; 0,1%; 0,2%; время обработки 24, 48, 72 часа), а также почки, пассированные на среду, содержащую колхицин в концентрации 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05% при той же временной экспозиции. Обработанные почки после экспозиции подвергались промыванию стерильной водой.
Важно отметить, что приживаемость промытых почек находилась в пределах 63,3 100%, без промывания —10,0 23,3 %. Очевидно процесс промывания позволяет не только убрать последействие полиплоидизирующего агента, но и уменьшить некротизацию обработанных тканей. После колхицинирования почки пересаживали на среду размножения, содержащую БАП в концентрации 2 мг/л среды, где наблюдалось замедленное развитие почек до конгомератов, а в последующих пассажах отсутствие вытягивания побегов. Дополнительное внесение в среду 1 мг/л ГК не повлияло на элонгацию побегов (Рис.1).
Микроразмножение колхицинированных почек яблони
а) сорт Болотовское б) сорт Имрус
За 4 пассажа микроразмножения максимальная высота побегов не превышала 10 мм. В данном случае возможно предположить не только ингибирующее действие колхицина на развитие почек, но и недостаточную концентрацию ГК. В последующих пассажах развитие конгломератов проходило в режиме не обработанных тканей, то есть увеличивалось образование почек и побегов, а линейный рост побегов был в норме.
Проведенные цитологические анализы в лаборатории цитоэмбриологии и генетики ВНИИСПК под руководством доктора с.х. наук Г.А. Седышевой выявили повышение плоидности обработанных тканей яблони. При капельном способе обработки точек роста сорта Болотовское колхицином в концентрации 0,2% в режиме 72 часов и Имрус при той же концентрации алкалоида, но в режиме 24 часов отмечены меристемы с триплоидным набором хромосом. С тетраплоидным набором хромосом полученымеристемы сорта Болотовское, обработанные 0,1% раствором колхицина и выдержанные 48 часов, а также меристемысорта Имрус при временной экспозиции 72 часа и концентрации колхицина 0,2%.Добавление колхицина в среду вызвало изменение плоидности точек роста у сорта Имрус при концентрации колхицина 0,01% и экспозиции в 24 часа. Причем,в этом варианте получены и тетраплоидные и триплоидные меристемы, но последних больше.У сорта Болотовское при этой же концентрации колхицина, но временной экспозиции48 часов отмечено наличие химерных тканей. Неравнозначное изменение плоидности меристемных тканей яблони,вероятно,связано с разной их чувствительностью к полиплоидизирующему агенту и диффундированием колхицина в делящиеся клетки или же степенью интенсивности клеточного деления в период воздействия колхицином.
Сравнивая оба способа полиплоидизации, более производительным предварительно можно считать капельный, поскольку при данномспособе обработки было выявлено индуцирование большего количества полиплоидных меристем.
Данные исследования свидетельствуют о сложностии в тоже время возможности реализации процессов регенерации сортов яблони in vitro. Оптимизация условий на этапах введения и микроразмножения позволяет тиражировать меристему яблони. Концентрация 6БАП в среде 2 мг/л определяет оптимальный коэффициент размножения. Для стабильности этого процесса необходимо учитывать все выше изложенные нюансы.
Возможности индукции полиплоидизации меристематических тканей яблони с геном Vfв условиях in vitro зафиксировано цитологическими исследованиями.
Получение полноценных растений с обязательным цитологическим анализом на плоидность каждого будет являться заключительным этапом данной разработки в условиях in vitro.
Ссылки на источники1.Жуковский П.М. Эволюция культурных растений на основе полиплоидии. В трудах: Полиплоидия и селекция. М.Л. Издво ''Наука'', 1965. С. 517.2.Туз А.С. Полиплоидия у плодовых культур. Вестник с.х. науки, 1965. №6. С. 1721.3.Лозицкий А.Я. Биологическая и хозяйственная характеристика полиплоидных сортов яблони и груши. Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук —Л., 1970. 20 с.4.Исаев С.И., Домрачева И.И. Использование полиплоидии в селекции яблони. В сборнике: Селекция яблони в СССР. Орел., 1981. С. 179 —185.5.Haskell G. Man, poliploidy and fruit tree growing in Britain. Evolution, N.J., 1955. P. 291 —301.6.Седов Е.Н., Седышева Г.А., Жданов В.В. Состояние и перспективы селекции яблони на полиплоидном уровне. В сборнике: Селекция яблони на улучшение качества плодов. Орел, 1985. С. 169 —178.7.Пономаренко В.В. Полиплоидия видов рода Malus Mill. В сб.: Селекция яблони на улучшение качества плодов. Орел, ВАСХНИЛ, 1985. С. 163 —168.8.Бавтуто Г.А. Экспериментальная автополиплоидия у яблони (Malus Mill). Тезисы докладов: Генетика и селекция растений. Л., 1977. С. 39 —40.9.Седов Е.Н. Значение и задачи селекции в улучшении сортимента и интенсификации производства плодов. В сб.: Селекция и сорторазведение садовых культур. Орел., 1992. С. 18 —35.10.Седышева Г.А. Полиплоидия и селекция яблони. В сб.: Селекция яблони в СССР. Орел., 1981. С. 192 —198.11.A Survey of Apple Clones in the United States. Agrecultural Research Service. U.S. Department of Agreculture., 1963. Р. 324.12.Кольцова Н.К. К методике искусственного вызывания полиплоидии колхицином. Докл. АН СССР, 1939. Т. 23. №5. С. 481 —484.13.Nebel B.R. Inducing changes in planets with colchicine shows progress Fm. Res. N. Y., 1940. V. 6. P. 10 —15.14.Щербаков В.К. Методы экспериментального получения полиплоидов у растений. Труды МОИП: Полиплоидия у растений. М., 1962. T. V. С. 110 —120.15.Терновский М.Ф. Преодоление бесплодия у межвидовых гибридов Nicotiana. В сб.: Полиплоидия и селекция. М. Л., издво ''Наука'', 1965. С. 70 —80.16.Рыбин В.А. Цитологический метод в селекции плодовых. М., ''Колос'', 1967. 216 с.17.Марьяхина И.Я., Полумордвинова И.В., Кокорева В.А., Луконина С.И. Биотехнология получения фертильных форм межвидовых гибридов лука на основе полиплоидизации in vitro. В сб.: Состояние и перспективы развития с. х. биотехнологии. М., 1986. С. 86 —91.18.Седышева Г.А., Седов Е.Н. Эффективность использования полиплоидии в создании адаптивных сортов яблони. В сб.: Роль сортов и новых технологий в интенсовном садоводстве. Орел., издво ГНУ ВНИИСПК, 2003. С. 323 —325.19.Марьяхина И.Я., Полумордвинова И.В., Московкин Л.И., Шевченко Г.С. Полиплоидизация in vitro основа для разработки биотехнологий в селекции лука и чеснока. Тезисы докладов V съезда ВОГИС, 1987. Т. IV. Ч. 4. С. 73 —74.20.Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии. Киев, 1980. 240 с.21.Леонтьев –ОрловО.А., ТрушечкинВ.Г., ВысоцкийВ.А..В сб.:Особенности культивирования изолированных апексов яблони invitro. Плодоводство в Нечерноземной полосе. –М., 1988. –С. 2130.22.Туровская Н.И. Микроразмножение яблони и груши invitro.Садоводство и виноградарство. –1994.№1. С. 10.23.Атрощенко Г.П., Самохин Г.М., ОрловаС.Ю.В сб.:Применение антиоксидантов в биотехнологии плодовых и ягодных культур. Использование биотехнологических методов для решения генетико –селекционных проблем. –Мичуринск, 1998. С. 2528.
DzhafarovaValentinaCandidateofagriculturalsciences, biotechnologylaboratoryhead.StateScientificInstitutionAllRussian Research Institute of Fruit Crop Breeding, Orel.Peculiarities of micro clonal propagation of apple with gene Vfand possibilities of inducing of polyploidy meristems in vitro.Abstract. The peculiarities of two stages of the micro clonal propagation of scab immune apple varieties are generalized in this paper. The optimization of the stages of meristems planting in the media and micro propagation allows copying varieties in a kind of buds and shoots (conglomerates).The selection of buds for colchicine treatment allows revealing the best variants: adventive buds at 34 mm size and apical buds up to 5 mm size.On the ground of meristem ploidy change as a result of the colchicine treatment it is concluded that there is a possibility to induce mitotic polyploidy tissues of apple varieties with gene Vf.Key words: apple, in vitro, propagation coefficient, colchicine, polyploidy meristems, triploid, tetraploid.
