Полиэлектролитные комплексы на основе фукоиданов и их производных
В.
Е. СупрунчукБиблиографическое описание статьи для цитирования:
Супрунчук
В.
Е. Полиэлектролитные комплексы на основе фукоиданов и их производных // Научно-методический электронный журнал «Концепт». –
2013. – Т. 3. – С.
2086–2090. – URL:
http://e-koncept.ru/2013/53420.htm.
Аннотация. Статья посвящена исследованию полиэлектролитных
комплексов на основе фукоиданов, возможности их создания и изучения свойств. В работе рассматриваются способы получения и очистки фукоиданов, а так же некоторые пути их химической модификации.
Ключевые слова:
полиэлектролитные комплексы, фукоиданы, микрочастицы, химическая модификация полисахаридов
Текст статьи
Супрунчук Виктория Евгеньевна
Студентка магистратуры 1го года обучения ФГАОУ ВПО «СевероКавказский Федеральный Университет», г. Ставропольvikasuprunchuk@gmail.comПолиэлектролитные комплексына основе фукоиданов и их производныхАннотация:Статья посвящена исследованию полиэлектролитных комплексов на основе фукоиданов, возможности их создания и изучения свойств. В работе рассматриваются способы получения и очистки фукоиданов, а так же некоторые пути их химической модификацииКлючевые слова:полиэлектролитные комплексы, фукоиданы, микрочастицы, химическая модификация полисахаридов.Большой интерес к исследованию полиэлектролитных комплексов(ПЭК), образуемых в результате взаимодействия противоположно заряженных полимеров, обусловлен широкой областьюих применения, основной направленностью которого является создание микрои наночастиц на их основе. Известно более десятка типов таких частиц, причем всостав некоторых из них могут входитьтолько природные полиионы(например, липосомы), либо только синтетические полимеры (полимерныемицеллы,полимерные наносферы),либо же и те и другие. Для стабилизации большинства типов частиц используютсяповерхностноактивные вещества(ПАВ)и эмульгаторы.Наиболее применяемыми для этих целейорганическими полимерами являются белки (желатин, альбумин), полисахариды (гуммиарабик), воска, парафин, поливиниловый спирт, поливинилхлорид, полиакриламид, полисилоксаны. Выбор материала оболочек и последующее строение микрочастицзависит от их назначения. Следует отметить, что синтетические микрочастицы являются гидрофобными, механически жесткими (не способными к набуханию в водной фазе) и не биодеградируемыми, в то время как основанные на природных полимерах относительно гидрофильны, способны к биои гидролитической деградации, а так же к набуханию в водной среде. Поэтому в некоторых случаях при рассмотрении данной проблематики акцент ставится на полимеры природного происхождения. Из природных же полимеров широко распространенными и постоянно воспроизводящимися в природеявляются полисахариды. Они являются доступной альтернативой синтетическим полимерам, т.к.обладают многими свойствами характерными для полимерных матриц, а именно, как правило, не токсичны, не вызывают аллергических реакций, не накапливаются в организме иобладают реакционноспособными функциональными группами, легко вступающие в химические реакции. Существует несколько способов получения ПЭК. Наиболее простым и часто применимым является смешение водного раствора поликатиона и полианиона. При этом в зависимости от целей используют различную последовательность смешивания водных растворов полиионов, а так же их водные растворы с различной концентрацией, ионной силой. Вследствие своей простоты данный метод получил широкое распространение, а как результат, претерпел множество модификаций. Так для получения ПЭК смешение водных растворов осуществляют путем постепенного прикапывания одного из компонентов; в некоторых случаях используют инжекторный способ; осуществляется так же образование эмульсий типа «водавводе»при достаточно высокой концентрации полимеров (например, эмульгирование водного раствора хитазана в водном растворе додецилсльфата натрия) и т.д.В качестве второго способа получения можно выделить такой способ, в котором образование ПЭК возможно при полимеризации ионных мономеров или же полиэлектролитов на противоположно заряженных матрицах различной природы, в частности и полиионных матрицах. Так в качестве матриц для ПЭК применяют коллоидные частицы с размером от десятков нанометров [1] до десятков микрон [2, 3], в качестве которых могут выступатьлатексные полистирольные частицы [4], неорганические карбонатные матрицы [5], кристаллы органических красителей [6,7], интактные клетки [8], белковые агрегаты [9]. Так, в работе Е.А.Марквичевой [10] в качестве матриц для создания полиэлектролитных микрокапсул использовали частицы СаСО3, что определило возможность создания ПЭК в физиологически оптимальных условиях, что в свою очередь позволяет иммобилизировать широкий спектрбелков. Результаты исследования подтверждают сохранение иммобилизированными белками их активности.В последние годы разработан метод «послойного» образования полиэлектролитных комплексов (ПЭК)на поверхности коллоидных частиц, в результате чего образуется достаточно плотная структура микрои нанокапсул, где толщина стенок определяется количеством слоев противоположно заряженных полиэлектролитов. Достоинством этого метода является то, что он позволяет избежать формирования осадка в объеме системы в момент смешивания полиэлектролитов.Из большогоразнообразиябиополимеровдля исследования нами были выбраны полисахариды, а именно фукоиданы, благодаря широкому спектру их физиологической активности.Так согласно литературным данным, фукоиданы обладают антикоагулянтной [11], антитромбической [12], противовирусной [13], противовоспалительной [14], противоопухолевой [15, 16],и некоторыми другими биологическимиактивностями, которая возрастает с увеличением молекулярной массыи содержания сульфатных групп. Интерестно, то, что фукоиданы ингибируют проникновение вируса имунодифицита человека (ВИЧ) в лимфоциты –мишени [17]. Исследования, проведенные в работе И. Д. Макаренковой [18] показали, что данные полисахаридыполученныеиз бурых водорослей L. Japonica, L. Cichorioides снижают адсорбцию и размножение хантавируса на культуре клеток Vero E6. В ряде работ показано, что противовирусная активность зависит от способа их экстрогирования, химической структуры, молекулярной массы, структуры фракций и содержания в них галактозы, глюкуроновых кислотных остатков. Фукоиданы
семейство высокосульфотированных, водорастворимых, обычно разветвленных гетеи гоморополисахаридов, где основным моносахаридным остатком выступает Lфукоза [19].Между собой могут отличаться по типу связей αфукозы, структурным сахарам, содержанию сульфатных групп и моносахоридному составу [20].Получают их в основном из бурых водорослей, но так же изнекоторых иглокожих.
В общем случаеструктуру можно представить как:
Рис.1.Структура фукоидана,гдеR = H, SO3, Ac; Fuc, GlcA, Man, Xyl, Gal.
Следует так же отметить, что для химической модификацииполисахаридов, в частностифукоиданов,может быть использован ряд реакций классической органической химии. Наиболее распространенным методом активации является периодатное окисление, позволяющее получать более реакционноспособную, по сравнению с гидроксильной,карбонильную группу, а так же конденсация с малоновым эфиром, благодаря чему,в полисахарид вводится карбоксильная группа.
Материалы и методы исследования
С учетом анализа литературы, нами был выбран способ позволяющий получить набор индивидуальных полисахаридов со стандартными характеристиками. Данный разработан Шевченко Н.М. и являетсязапатентованнойтехнологией [21].Полученный препарат фукоиданов имел бурую окраску вследствие присутствия полифенольных соединений.Известно, что с полисахаридами, в частности фукоиданами,плотно ассоциированы полифенольные соединения, связывающиенесколько молекулполисахаридов между собой или опутывающиеих.Природа такого взаимодействия еще не изучена, однакоэто обуславливает необходимость введения стадии очистки полисахарида,при условии сохраненияего цепи. Для обесцвечивания природных полисахаридов используют перекись водорода [22], при этом нами была подобрана методика при применении которой сохраняется структура полисахарида, рассмотренная в работе [23].Обработанный полисахарид хромотографировали на колонке (3×15 см) с DEAEцеллюлозой линейным градиентом 0…2 М вода / NaCl (500 мл / 500 мл) со скоростью 1,1 мл/мин. Наличие полисахарида в полученных пробах определяли методом, основанным на реакции взаимодействия полисахарида с резорцином в кислой среде и последующем фотометрическом измерении продукта реакции окрашенного в краснооранжевый цвет, при длине волны 480 нмна фотоэлектроколориметре «КФК –2».
Пробы, в которых присутствовал фукоиданы, вновь осаждали спиртом, отфильтровывали и высушивали. Полученный таким образом полисахарид представлял собой порошок светлобежевого цвета. Так же для установления состава полученного полисахарида был проведен кислотный гидролиз с последующей тонкослойной хроматографией (ТСХ).Кислотный гидролиз полученного полисахарида проводили в 2н. HCl, при 60 0С в течение 6ти часов, в круглодонной колбе, снабженной холодильником. Идентификация препарата проводили методом тонкослойной хроматографии напластинах «Silufol[24]. Состав разделяющей смеси: уксусная кислота
нбутанол вода (60 мл 15 мл 25 мл). Используемый проявляющий реагент: нбутанолводауксусная кислота фосфорная кислотадифениламин (60 мл 25 мл –10 мл –1 мл –2 г). По окончании хроматографирования пластину сушили при температуре 120 0С.В результате проведенного кислотного гидролиза и последующей ТСХ было установлено, что в состав полученного полисахарида входят остатки фукозы, ксилоза, моноза, галактоза и глюкоза.Окисление фукоиданов осуществлялипо стандартной методике окисления полисахаридов, позволяющей свести к минимуму побочные процессы. Реакцию вели в воде, равные объемы 0,1 М раствора периодата натрия и 1% раствор полисахарида смешивали и выдерживали в темноте для избегания «сверхокисления». Для удаления низкомолекулярныхсоставляющих диализировали, осаждали этанолом. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали на пористом стеклянном фильтре дистиллированной водой, затем спиртом, сушили.
Полученный полиальдегид представляет собой порошок белого цвета, растворимый в воде, не растворим в спирте, эфире.Как метод активации полисахаридов нами был так же рассмотрен метод конденсации полисахаридов с малоновым эфиром. Реакцию с полисахаридальдегидом вели в диметилсульфоксиде (ДМСО) в присутствии металлического натрия при 20 0С в течение 2 часов. Продукт реакции осаждали хлороформом, промывали ацетоном.
Таким образом, химические свойства фукоиданов, как и остальных полисахаридов,зависят от эксперементальных условий (время проведения реакции, температура, растворитель, реагенты), строения, и состава;трудностью является достижения полноты реакции по всем функциональным группам, а так жепроведениереакций, имеющих избирательный характер. Дляхимической модификации может быть использовано множество реакций классической органической химии, при этом их выбор определяется поставленными целями.Общий принцип получения микрочастиц, образуемых из гидрофобныхи гидрофильных веществ основан на полученииэмульсий видамасло/вода иливода/масло, а также различного рода дисперсий.Микрочастицы, образованные в масляной или органической среде, получают внося в нее раствор полисахарида иливодный раствор., которые затем диспергируют до необходимого размера и затем отверждают с помощью поперечносшивающих реагентов или тепловой денатурацией.Такие частицы способны к биои гидролитической деградации, относительно гидрофильны, набухаютвводной среде.Следует отметить, что синтетические микросферы являются небиодеградируемыми,гидрофобны, механически жесткие(не способными к набуханию в водной фазе) и. Кроме того, в последние годы усилия многих исследователей были направлены на получение полимерных микрочастиц, имеющих в своем составе функциональные группы, способные связывать белки, иммуноглобулины или другие молекулы путем формирования ковалентной связи.Так же синтетические полимеры обладают существенным недостатком –это способностьнакапливаться в организме. Таким образом, природные полимеры –это доступная альтернатива синтетическим, обладающая реакционноспособными функциональными группами, легко вступающих в химическоевзаимодействие. Также характерной особенностью полисахаридовявляется их высокая гидрофильность и разрушение их путем ферментативного гидролиза. Однако природные полимеры обладают так же и недостатками, а именно неустойчивость к воздействию микроорганизмов.Для получения микрочастиц нами была оптимизирована методика [25]и методика[26], позволяющая получать полиакриламидные микрочастицыпутем полимеризации водной эмульсии акриламида и бисметакриламида в гексане. Согласно этим методикам исследования проводилипри варьировании концентрации полисахаридного компонента,эмульгаторов и стабилизаторов.В соответствии с чем было полученодесять образцов различного содержания, включающие: микрочастицыполученные непосредственно по методике; микрочастицы, в которых осуществлялось введение фукоидана в соотношении 1:1, 1:3 в отношении акриламидного раствора; микрочастицыс полной заменой 30% раствора акриламида/бисакриламида на раствор фукоидана, с последующим изменением концентрацийэмульгаторов и стабилизаторов:1 образец, полученный по методике 1;2, 7 образцы, полученные полной заменой акриламидного раствора на водный раствор фукоидана с использованием различных эмульгаторов (во втором использовался ПЭГ, в седьмом циклометикон); 3, 4 образцы, полученные заменой акриламидного раствора в соотношении 1:1 и 1:3 соответственно;5, 8 образцы, образованные в результате замены акриламидного раствора на производные полисахарида, так в 5 произвели замену на полисахаридальдегид, 8 на производное, полученное в результате конденсации с малоновым эфиром.6 образец полученный по второй методике;9,10 образцы, полученныепо второй методике путем замены цианоакрилатанарастворполисахарида и ПА соответственно.
Полученные в работе образцы ПЭК фотографировали с помощью фотонасадки DCM300 в одинаковых условиях (объем нанесения на предметное стекло, увеличение х120). Для определения локализации полисахарида ПЭК были окрашены 0,02 М раствором AgNO3.
Результаты и обсуждение
Основные стадии получения микрочастиц состоят из получения фракций фукоиданов с последующей отчисткой от полифенолов, исследования влияния природы и концентрациидействующего вещества на образование, размеры и стабильность наносистем. Важным критерием для формирования ПЭК является получение стабильных во времени микрочастиц. Устойчивость определялось путем подсчета количества частицс помощью камеры Гаряева. Измерения проводили в течениетрех месяцев (рис.2).
Рис.2. Стабильность ПЭК полученных по методике 1Из рис 2. видно, чтомикрочастицы полученные с использованиемполиакриламида и фукоидана в отдельности обладают приблизительно одинаковой устойчивостью во времени. Однако при совместном использовании данных полиэлектролитов в различныхсоотношениях (1:1 и 1:3), стабильность частиц уменьшается, что может свидетельствовать об отсутствии взаимодействий между полимерами.При рассмотрении образцов 2 и 7 можно сделать вывод, что природа эмульгатора существенного влияния на устойчивость во времени не оказывает. Так же установлено что в образцах 3 и4 произошлочастичное капсулирование фукоиданаи егоабсорбция на поверхности частиц, а в 2,7 осуществилось включение непосредственно в стенку микрочастиц.Наличие рекционноспособных функциональных групп в полисахаридах, а так же использование эмульгатора на полидиметилсилоксановой основе позволяет создавать устойчивые микрочастицыкоторые могут служить для инкапсуляции различного рода веществ.
Рис.3. Стабильность ПЭК полученных по методике 2
ПЭК полученные на основе методики 2 с использованием полисахарида не отличаются высокой стабильностью во времени, в свою очередь образцы с применением ПА в устойчивости не уступают контролю.Так же микрочастицы не претерпели значительных изменений, при условии хранения их при комнатной температуре.Из полученныхснимков установлено,что наименьшим размером обладают ПЭК основанные на производных фукоидана, а именно продукте конденсации полисахарида с малоновым эфиром. При этом ПЭК на основе ПА можно отнести к такому типу микрочастиц как «капсула в капсуле» (рис.3), представляющих собой эмульсию микрочастиц, включенных под общую оболочку. Такой тип, несмотря на весьма большие размеры, обладает достаточно большойустойчивостью.
Рис.3.Капсула в капсуле
Так же следует отметить, что природа эмульгатора существенного влияния на размеры частиц не оказывает.Изменение концентрации фукоидана приводит к изменению размеров частиц, так с помощью камеры Гаряева было установлено, что с увеличением концентрации фукоидана в системе происходит некоторое уменьшение размера частиц. Все остальные микрочастицы имеют схожие размеры.
Выводы
1. Получена фракция фукоидана, очищенная от низкомолекулярных соединений, а так же соединений неуглеводной природы, с сохранением структуры полисахарида и проведена его химическая модификация поактивному компоненту, а именно, осуществлено периодатное окисление фукоидана, с образованием полисахаридальдегида,синтез с малоновым эфиром, в результате которого в структуру полимера была введена карбоксильная группа.2. Оптимизирована методика получения полиэлектролитных микрочастиц на основе фукоидана. Микрочастицы полученные на основе полиакриламида и фукоидана в отдельности обладают приблизительно одинаковой устойчивостью во времени, но при их совместном использовании в разных соотношениях (1:1 и 1:3), стабильность их уменьшается, что может свидетельствовать об отсутствии взаимодействий между полимерами.3. Исследовано влияние природы и концентрации действующего вещества на образование, размеры и стабильность микросистем. Установлено, что природа эмульгатора существенного влияния на устойчивость во времени и размеры микрочастиц не оказывает. Наименьшим размером обладают ПЭК основанные на продукте конденсации ПА с малоновым эфиром. При этом ПЭК на основе ПА являются «капсулой в капсуле», обладающийбольшей устойчивостью.
Ссылки на источники
1.Mayya S., Schoeler ,B., Caruso, F. Preparanion and organization of nanoscale polyalactrolytecoated gold nanoparticles // Adv. Funct. Mater. 2003 V. 13. №3. –P. 183188. 2. Qiu , X.P., Leporatti, Mohwald, H S., Donath, E.,. Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles // Langmuir. 2001. V. 17 №17 –P. 53755380. 3.
Shenoy, D.B., SukhorukovG.B., Antipov, A.A Mohwald, H. LayerbyLayer Engineering of Biocompatible, Decomposable CoreShell Structures // Biomacromolecules. 2003. –V.4. №2. P. 265272. 4. Sukhorukov, G.B., Davis S., Donath, E., Lichtenfeld, H., Caruso, F., Popov, V.I., Mohwald, H. Stepwise polyalectrolyte assembly on particles surface: a novel approach to colloid design // Polym. Adv. Technol. 1998. V. 9 № 10 –P. 759767. 5.
Antipov, A.A., Shchukin, D., Petrov, A.I., Fedutik, Y., Sukhorukov, G.B., Mohwald , H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication // Colloid. Surf.: Physicochem. Ang. Aspects, 2003. V. 2 №24 –P. 175184. 6.
Antipov , A.A., Sukhorukov G.B., Donath E., Mohwald H. Sustained release properties of polyelecyrolyte multiplayer capsules // J. Phys. Chem. B. 2001. V. 10 №12 –P. 22812284. 7.Caruso , F., Yang , W.J., Trau, D., Renneberg, R. Microencapsulating of uncharged low molecular weight materials by polyelectrolyte multilayer selfassembly // Langmuir. 2000. V. 16 №23 –P. 89328936. 8. Donath, E., Sukhorukov, G.B., Mohwald H. Submicrometric and micrometric polyelectrolyte capsules // Nachrichten Aus Chemie Technik Und Laboratorium. 1999. V.4. №47 P. 400405. 9.Бобрешова, М., Сухоруков, Г.Б., Сабурова, Е.А., Елфимова, Л.И., Шабарчина, Л.И., Сухоруков, Б.И. Лактатдегидрогеназа в интерполиэлектролитном комплексе// Функция и стабильность, Биофизика. –1999. –т.44. –№5. –С. 813820. 10.Марквичева, Е.А., Ворожцов, Г.Н., Румш, Л.Д., Бородина, Т.Н., Кунижев, С.М., Сухоруков, Г.Б., Фельдман, Б.М.Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки биологически активных веществ –М.:Биомедицинская химия, 2007. –9с. 11.Кузнецова, Т.А., Беседнова, Н.Н., Мамаев, А.Н. идр. Антикоагулянтная активность фукоидана из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens // Бюл. экспер. биол. –2003. –т. 136. –№11. –С.532534. 12.Nishino, T., Fukuda, A., Nagumo, T. et al. Inhibition of the generation of thrombin and factor Xa by a fucoidan from the brown seaweed Ecklonia kurome // Thromb. Res.,1999. –Vol.96. –P.3749. 13.
Mandal, P., Mateu, C.G., Chattopadhyay, K. et al. Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica // Antiviral Chemystry and Chemotherapy. –2007. –Vol.18, №3. –P.153162.14.
Семенов, А.В., Мазуров А.В., Преображенская М.Е. идр. Сульфатированные полисахариды как ингибиторы рецепторной активности Рселектинов и Рселектинового воспаления // Вопр. мед. химии. –1999. –т. 44, вып. 2. –С.135143. 15.
Ellouali, M., BoissonVidal, C., Durand , P., Jozefonvicz, J. Antitumoractivity of low molecular weight fucans extracted from brown seaweed Ascophyllum nodosum // Anticancer Res. –1993. –Vol.13. –P.20112019. 16.
Itoh, H., Noda, H., Amano, H. Antitumor activity and immunological properties of marine algal polysaccharides, especially fucoidan, prepared from Sargassum thunbergii of Phaeophyceae. // Anticancer Research. –1993. –Vol.13. –P.20452052. 17.
McClure, M.O., Moore, J.P., Blanc, D.F. Investigations into the mechanism by which sulfated polysaccharides inhibit HIV infection in vitro // AIDS Res. Hum. Retroviruses. –1992. –Vol.8. –P.1926. 18.
Макаренкова, И.Д., Компанец, Г.Г., Беседнова, Н.Н. идр. Скрининг биополимеров из морских гидробионтов, влияющих на адсорбцию вируса Хантаан // Вопросы вирусологии –2007. –№2. –С.2932. 19.19 Berteao O., Mullou B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide// Glycobiology. –2003. –Vol. 13, №6. –P. 2940 20.
Шевченко, Н.М. Строение, биологическая активность полисахаридов некоторых бурых водорослей и продуктов их ферментативной трансформации / дис. канд. хим. наук. —Владивосток, 2001. –91 с. 21.Патент РФ 2240816. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением препаратов для медицины и косметологии. 22.Колмакова, О.А., Пен, Р.З., Шапиро, И.Л., Бывшев, А.В., Тарабанько, В.Е. Низкотемпературная окислительная делигнификация древесины. Химические свойства пероксидной целлюлозы // Химия растительного сырья. –2003. –№1. –С. 39–43. 23.Урванцева, А.М., Бакунина И.Ю., Ким Н.Ю., Исаков В.В., Глазунов В.П., Звягинцева Т.Н. Выделение очищенного фукоидана из природного комплекса с полифенолами и его характеристика // Химия растительного сырья. –2004. –№3. –С. 15–24. 24.Bush, A., MartinPastor, M. Structure and conformation of complex carbohydrates of glycoproteins, glycolipids, and bacterial polysaccharides C // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1999 –V.28. –P.269293.
25.United States Patent 6,235,313. Bioadhesive microspheres and their use as drug delivery and imaging systems.26.ПатентРФ2145498 Фармацевтический состав, содержащий нанокапсулы, и способ его получения.
Suprunchuk Victoria E. Magistracy student of the first year FGAOU VPO "NorthCaucasian Federal University", Stavropol vikasuprunchuk@gmail.com Polyelectrolyte complexes based on fucoidan and their derivatives Abstract:The article deals with polyelectrolyte complexes based on fucoidan, the possibility of their creation and characterization. This paper deals with methods for producing and purifying fucoidan, as well as some of the methods of chemical modificationKeywords: polyelectrolyte complexes, fucoidan, microparticles, chemical modification of polysaccharides.
Студентка магистратуры 1го года обучения ФГАОУ ВПО «СевероКавказский Федеральный Университет», г. Ставропольvikasuprunchuk@gmail.comПолиэлектролитные комплексына основе фукоиданов и их производныхАннотация:Статья посвящена исследованию полиэлектролитных комплексов на основе фукоиданов, возможности их создания и изучения свойств. В работе рассматриваются способы получения и очистки фукоиданов, а так же некоторые пути их химической модификацииКлючевые слова:полиэлектролитные комплексы, фукоиданы, микрочастицы, химическая модификация полисахаридов.Большой интерес к исследованию полиэлектролитных комплексов(ПЭК), образуемых в результате взаимодействия противоположно заряженных полимеров, обусловлен широкой областьюих применения, основной направленностью которого является создание микрои наночастиц на их основе. Известно более десятка типов таких частиц, причем всостав некоторых из них могут входитьтолько природные полиионы(например, липосомы), либо только синтетические полимеры (полимерныемицеллы,полимерные наносферы),либо же и те и другие. Для стабилизации большинства типов частиц используютсяповерхностноактивные вещества(ПАВ)и эмульгаторы.Наиболее применяемыми для этих целейорганическими полимерами являются белки (желатин, альбумин), полисахариды (гуммиарабик), воска, парафин, поливиниловый спирт, поливинилхлорид, полиакриламид, полисилоксаны. Выбор материала оболочек и последующее строение микрочастицзависит от их назначения. Следует отметить, что синтетические микрочастицы являются гидрофобными, механически жесткими (не способными к набуханию в водной фазе) и не биодеградируемыми, в то время как основанные на природных полимерах относительно гидрофильны, способны к биои гидролитической деградации, а так же к набуханию в водной среде. Поэтому в некоторых случаях при рассмотрении данной проблематики акцент ставится на полимеры природного происхождения. Из природных же полимеров широко распространенными и постоянно воспроизводящимися в природеявляются полисахариды. Они являются доступной альтернативой синтетическим полимерам, т.к.обладают многими свойствами характерными для полимерных матриц, а именно, как правило, не токсичны, не вызывают аллергических реакций, не накапливаются в организме иобладают реакционноспособными функциональными группами, легко вступающие в химические реакции. Существует несколько способов получения ПЭК. Наиболее простым и часто применимым является смешение водного раствора поликатиона и полианиона. При этом в зависимости от целей используют различную последовательность смешивания водных растворов полиионов, а так же их водные растворы с различной концентрацией, ионной силой. Вследствие своей простоты данный метод получил широкое распространение, а как результат, претерпел множество модификаций. Так для получения ПЭК смешение водных растворов осуществляют путем постепенного прикапывания одного из компонентов; в некоторых случаях используют инжекторный способ; осуществляется так же образование эмульсий типа «водавводе»при достаточно высокой концентрации полимеров (например, эмульгирование водного раствора хитазана в водном растворе додецилсльфата натрия) и т.д.В качестве второго способа получения можно выделить такой способ, в котором образование ПЭК возможно при полимеризации ионных мономеров или же полиэлектролитов на противоположно заряженных матрицах различной природы, в частности и полиионных матрицах. Так в качестве матриц для ПЭК применяют коллоидные частицы с размером от десятков нанометров [1] до десятков микрон [2, 3], в качестве которых могут выступатьлатексные полистирольные частицы [4], неорганические карбонатные матрицы [5], кристаллы органических красителей [6,7], интактные клетки [8], белковые агрегаты [9]. Так, в работе Е.А.Марквичевой [10] в качестве матриц для создания полиэлектролитных микрокапсул использовали частицы СаСО3, что определило возможность создания ПЭК в физиологически оптимальных условиях, что в свою очередь позволяет иммобилизировать широкий спектрбелков. Результаты исследования подтверждают сохранение иммобилизированными белками их активности.В последние годы разработан метод «послойного» образования полиэлектролитных комплексов (ПЭК)на поверхности коллоидных частиц, в результате чего образуется достаточно плотная структура микрои нанокапсул, где толщина стенок определяется количеством слоев противоположно заряженных полиэлектролитов. Достоинством этого метода является то, что он позволяет избежать формирования осадка в объеме системы в момент смешивания полиэлектролитов.Из большогоразнообразиябиополимеровдля исследования нами были выбраны полисахариды, а именно фукоиданы, благодаря широкому спектру их физиологической активности.Так согласно литературным данным, фукоиданы обладают антикоагулянтной [11], антитромбической [12], противовирусной [13], противовоспалительной [14], противоопухолевой [15, 16],и некоторыми другими биологическимиактивностями, которая возрастает с увеличением молекулярной массыи содержания сульфатных групп. Интерестно, то, что фукоиданы ингибируют проникновение вируса имунодифицита человека (ВИЧ) в лимфоциты –мишени [17]. Исследования, проведенные в работе И. Д. Макаренковой [18] показали, что данные полисахаридыполученныеиз бурых водорослей L. Japonica, L. Cichorioides снижают адсорбцию и размножение хантавируса на культуре клеток Vero E6. В ряде работ показано, что противовирусная активность зависит от способа их экстрогирования, химической структуры, молекулярной массы, структуры фракций и содержания в них галактозы, глюкуроновых кислотных остатков. Фукоиданы
семейство высокосульфотированных, водорастворимых, обычно разветвленных гетеи гоморополисахаридов, где основным моносахаридным остатком выступает Lфукоза [19].Между собой могут отличаться по типу связей αфукозы, структурным сахарам, содержанию сульфатных групп и моносахоридному составу [20].Получают их в основном из бурых водорослей, но так же изнекоторых иглокожих.
В общем случаеструктуру можно представить как:
Рис.1.Структура фукоидана,гдеR = H, SO3, Ac; Fuc, GlcA, Man, Xyl, Gal.
Следует так же отметить, что для химической модификацииполисахаридов, в частностифукоиданов,может быть использован ряд реакций классической органической химии. Наиболее распространенным методом активации является периодатное окисление, позволяющее получать более реакционноспособную, по сравнению с гидроксильной,карбонильную группу, а так же конденсация с малоновым эфиром, благодаря чему,в полисахарид вводится карбоксильная группа.
Материалы и методы исследования
С учетом анализа литературы, нами был выбран способ позволяющий получить набор индивидуальных полисахаридов со стандартными характеристиками. Данный разработан Шевченко Н.М. и являетсязапатентованнойтехнологией [21].Полученный препарат фукоиданов имел бурую окраску вследствие присутствия полифенольных соединений.Известно, что с полисахаридами, в частности фукоиданами,плотно ассоциированы полифенольные соединения, связывающиенесколько молекулполисахаридов между собой или опутывающиеих.Природа такого взаимодействия еще не изучена, однакоэто обуславливает необходимость введения стадии очистки полисахарида,при условии сохраненияего цепи. Для обесцвечивания природных полисахаридов используют перекись водорода [22], при этом нами была подобрана методика при применении которой сохраняется структура полисахарида, рассмотренная в работе [23].Обработанный полисахарид хромотографировали на колонке (3×15 см) с DEAEцеллюлозой линейным градиентом 0…2 М вода / NaCl (500 мл / 500 мл) со скоростью 1,1 мл/мин. Наличие полисахарида в полученных пробах определяли методом, основанным на реакции взаимодействия полисахарида с резорцином в кислой среде и последующем фотометрическом измерении продукта реакции окрашенного в краснооранжевый цвет, при длине волны 480 нмна фотоэлектроколориметре «КФК –2».
Пробы, в которых присутствовал фукоиданы, вновь осаждали спиртом, отфильтровывали и высушивали. Полученный таким образом полисахарид представлял собой порошок светлобежевого цвета. Так же для установления состава полученного полисахарида был проведен кислотный гидролиз с последующей тонкослойной хроматографией (ТСХ).Кислотный гидролиз полученного полисахарида проводили в 2н. HCl, при 60 0С в течение 6ти часов, в круглодонной колбе, снабженной холодильником. Идентификация препарата проводили методом тонкослойной хроматографии напластинах «Silufol[24]. Состав разделяющей смеси: уксусная кислота
нбутанол вода (60 мл 15 мл 25 мл). Используемый проявляющий реагент: нбутанолводауксусная кислота фосфорная кислотадифениламин (60 мл 25 мл –10 мл –1 мл –2 г). По окончании хроматографирования пластину сушили при температуре 120 0С.В результате проведенного кислотного гидролиза и последующей ТСХ было установлено, что в состав полученного полисахарида входят остатки фукозы, ксилоза, моноза, галактоза и глюкоза.Окисление фукоиданов осуществлялипо стандартной методике окисления полисахаридов, позволяющей свести к минимуму побочные процессы. Реакцию вели в воде, равные объемы 0,1 М раствора периодата натрия и 1% раствор полисахарида смешивали и выдерживали в темноте для избегания «сверхокисления». Для удаления низкомолекулярныхсоставляющих диализировали, осаждали этанолом. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали на пористом стеклянном фильтре дистиллированной водой, затем спиртом, сушили.
Полученный полиальдегид представляет собой порошок белого цвета, растворимый в воде, не растворим в спирте, эфире.Как метод активации полисахаридов нами был так же рассмотрен метод конденсации полисахаридов с малоновым эфиром. Реакцию с полисахаридальдегидом вели в диметилсульфоксиде (ДМСО) в присутствии металлического натрия при 20 0С в течение 2 часов. Продукт реакции осаждали хлороформом, промывали ацетоном.
Таким образом, химические свойства фукоиданов, как и остальных полисахаридов,зависят от эксперементальных условий (время проведения реакции, температура, растворитель, реагенты), строения, и состава;трудностью является достижения полноты реакции по всем функциональным группам, а так жепроведениереакций, имеющих избирательный характер. Дляхимической модификации может быть использовано множество реакций классической органической химии, при этом их выбор определяется поставленными целями.Общий принцип получения микрочастиц, образуемых из гидрофобныхи гидрофильных веществ основан на полученииэмульсий видамасло/вода иливода/масло, а также различного рода дисперсий.Микрочастицы, образованные в масляной или органической среде, получают внося в нее раствор полисахарида иливодный раствор., которые затем диспергируют до необходимого размера и затем отверждают с помощью поперечносшивающих реагентов или тепловой денатурацией.Такие частицы способны к биои гидролитической деградации, относительно гидрофильны, набухаютвводной среде.Следует отметить, что синтетические микросферы являются небиодеградируемыми,гидрофобны, механически жесткие(не способными к набуханию в водной фазе) и. Кроме того, в последние годы усилия многих исследователей были направлены на получение полимерных микрочастиц, имеющих в своем составе функциональные группы, способные связывать белки, иммуноглобулины или другие молекулы путем формирования ковалентной связи.Так же синтетические полимеры обладают существенным недостатком –это способностьнакапливаться в организме. Таким образом, природные полимеры –это доступная альтернатива синтетическим, обладающая реакционноспособными функциональными группами, легко вступающих в химическоевзаимодействие. Также характерной особенностью полисахаридовявляется их высокая гидрофильность и разрушение их путем ферментативного гидролиза. Однако природные полимеры обладают так же и недостатками, а именно неустойчивость к воздействию микроорганизмов.Для получения микрочастиц нами была оптимизирована методика [25]и методика[26], позволяющая получать полиакриламидные микрочастицыпутем полимеризации водной эмульсии акриламида и бисметакриламида в гексане. Согласно этим методикам исследования проводилипри варьировании концентрации полисахаридного компонента,эмульгаторов и стабилизаторов.В соответствии с чем было полученодесять образцов различного содержания, включающие: микрочастицыполученные непосредственно по методике; микрочастицы, в которых осуществлялось введение фукоидана в соотношении 1:1, 1:3 в отношении акриламидного раствора; микрочастицыс полной заменой 30% раствора акриламида/бисакриламида на раствор фукоидана, с последующим изменением концентрацийэмульгаторов и стабилизаторов:1 образец, полученный по методике 1;2, 7 образцы, полученные полной заменой акриламидного раствора на водный раствор фукоидана с использованием различных эмульгаторов (во втором использовался ПЭГ, в седьмом циклометикон); 3, 4 образцы, полученные заменой акриламидного раствора в соотношении 1:1 и 1:3 соответственно;5, 8 образцы, образованные в результате замены акриламидного раствора на производные полисахарида, так в 5 произвели замену на полисахаридальдегид, 8 на производное, полученное в результате конденсации с малоновым эфиром.6 образец полученный по второй методике;9,10 образцы, полученныепо второй методике путем замены цианоакрилатанарастворполисахарида и ПА соответственно.
Полученные в работе образцы ПЭК фотографировали с помощью фотонасадки DCM300 в одинаковых условиях (объем нанесения на предметное стекло, увеличение х120). Для определения локализации полисахарида ПЭК были окрашены 0,02 М раствором AgNO3.
Результаты и обсуждение
Основные стадии получения микрочастиц состоят из получения фракций фукоиданов с последующей отчисткой от полифенолов, исследования влияния природы и концентрациидействующего вещества на образование, размеры и стабильность наносистем. Важным критерием для формирования ПЭК является получение стабильных во времени микрочастиц. Устойчивость определялось путем подсчета количества частицс помощью камеры Гаряева. Измерения проводили в течениетрех месяцев (рис.2).
Рис.2. Стабильность ПЭК полученных по методике 1Из рис 2. видно, чтомикрочастицы полученные с использованиемполиакриламида и фукоидана в отдельности обладают приблизительно одинаковой устойчивостью во времени. Однако при совместном использовании данных полиэлектролитов в различныхсоотношениях (1:1 и 1:3), стабильность частиц уменьшается, что может свидетельствовать об отсутствии взаимодействий между полимерами.При рассмотрении образцов 2 и 7 можно сделать вывод, что природа эмульгатора существенного влияния на устойчивость во времени не оказывает. Так же установлено что в образцах 3 и4 произошлочастичное капсулирование фукоиданаи егоабсорбция на поверхности частиц, а в 2,7 осуществилось включение непосредственно в стенку микрочастиц.Наличие рекционноспособных функциональных групп в полисахаридах, а так же использование эмульгатора на полидиметилсилоксановой основе позволяет создавать устойчивые микрочастицыкоторые могут служить для инкапсуляции различного рода веществ.
Рис.3. Стабильность ПЭК полученных по методике 2
ПЭК полученные на основе методики 2 с использованием полисахарида не отличаются высокой стабильностью во времени, в свою очередь образцы с применением ПА в устойчивости не уступают контролю.Так же микрочастицы не претерпели значительных изменений, при условии хранения их при комнатной температуре.Из полученныхснимков установлено,что наименьшим размером обладают ПЭК основанные на производных фукоидана, а именно продукте конденсации полисахарида с малоновым эфиром. При этом ПЭК на основе ПА можно отнести к такому типу микрочастиц как «капсула в капсуле» (рис.3), представляющих собой эмульсию микрочастиц, включенных под общую оболочку. Такой тип, несмотря на весьма большие размеры, обладает достаточно большойустойчивостью.
Рис.3.Капсула в капсуле
Так же следует отметить, что природа эмульгатора существенного влияния на размеры частиц не оказывает.Изменение концентрации фукоидана приводит к изменению размеров частиц, так с помощью камеры Гаряева было установлено, что с увеличением концентрации фукоидана в системе происходит некоторое уменьшение размера частиц. Все остальные микрочастицы имеют схожие размеры.
Выводы
1. Получена фракция фукоидана, очищенная от низкомолекулярных соединений, а так же соединений неуглеводной природы, с сохранением структуры полисахарида и проведена его химическая модификация поактивному компоненту, а именно, осуществлено периодатное окисление фукоидана, с образованием полисахаридальдегида,синтез с малоновым эфиром, в результате которого в структуру полимера была введена карбоксильная группа.2. Оптимизирована методика получения полиэлектролитных микрочастиц на основе фукоидана. Микрочастицы полученные на основе полиакриламида и фукоидана в отдельности обладают приблизительно одинаковой устойчивостью во времени, но при их совместном использовании в разных соотношениях (1:1 и 1:3), стабильность их уменьшается, что может свидетельствовать об отсутствии взаимодействий между полимерами.3. Исследовано влияние природы и концентрации действующего вещества на образование, размеры и стабильность микросистем. Установлено, что природа эмульгатора существенного влияния на устойчивость во времени и размеры микрочастиц не оказывает. Наименьшим размером обладают ПЭК основанные на продукте конденсации ПА с малоновым эфиром. При этом ПЭК на основе ПА являются «капсулой в капсуле», обладающийбольшей устойчивостью.
Ссылки на источники
1.Mayya S., Schoeler ,B., Caruso, F. Preparanion and organization of nanoscale polyalactrolytecoated gold nanoparticles // Adv. Funct. Mater. 2003 V. 13. №3. –P. 183188. 2. Qiu , X.P., Leporatti, Mohwald, H S., Donath, E.,. Studies on the drug release properties of polysaccharide multilayers encapsulated ibuprofen microparticles // Langmuir. 2001. V. 17 №17 –P. 53755380. 3.
Shenoy, D.B., SukhorukovG.B., Antipov, A.A Mohwald, H. LayerbyLayer Engineering of Biocompatible, Decomposable CoreShell Structures // Biomacromolecules. 2003. –V.4. №2. P. 265272. 4. Sukhorukov, G.B., Davis S., Donath, E., Lichtenfeld, H., Caruso, F., Popov, V.I., Mohwald, H. Stepwise polyalectrolyte assembly on particles surface: a novel approach to colloid design // Polym. Adv. Technol. 1998. V. 9 № 10 –P. 759767. 5.
Antipov, A.A., Shchukin, D., Petrov, A.I., Fedutik, Y., Sukhorukov, G.B., Mohwald , H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication // Colloid. Surf.: Physicochem. Ang. Aspects, 2003. V. 2 №24 –P. 175184. 6.
Antipov , A.A., Sukhorukov G.B., Donath E., Mohwald H. Sustained release properties of polyelecyrolyte multiplayer capsules // J. Phys. Chem. B. 2001. V. 10 №12 –P. 22812284. 7.Caruso , F., Yang , W.J., Trau, D., Renneberg, R. Microencapsulating of uncharged low molecular weight materials by polyelectrolyte multilayer selfassembly // Langmuir. 2000. V. 16 №23 –P. 89328936. 8. Donath, E., Sukhorukov, G.B., Mohwald H. Submicrometric and micrometric polyelectrolyte capsules // Nachrichten Aus Chemie Technik Und Laboratorium. 1999. V.4. №47 P. 400405. 9.Бобрешова, М., Сухоруков, Г.Б., Сабурова, Е.А., Елфимова, Л.И., Шабарчина, Л.И., Сухоруков, Б.И. Лактатдегидрогеназа в интерполиэлектролитном комплексе// Функция и стабильность, Биофизика. –1999. –т.44. –№5. –С. 813820. 10.Марквичева, Е.А., Ворожцов, Г.Н., Румш, Л.Д., Бородина, Т.Н., Кунижев, С.М., Сухоруков, Г.Б., Фельдман, Б.М.Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки биологически активных веществ –М.:Биомедицинская химия, 2007. –9с. 11.Кузнецова, Т.А., Беседнова, Н.Н., Мамаев, А.Н. идр. Антикоагулянтная активность фукоидана из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens // Бюл. экспер. биол. –2003. –т. 136. –№11. –С.532534. 12.Nishino, T., Fukuda, A., Nagumo, T. et al. Inhibition of the generation of thrombin and factor Xa by a fucoidan from the brown seaweed Ecklonia kurome // Thromb. Res.,1999. –Vol.96. –P.3749. 13.
Mandal, P., Mateu, C.G., Chattopadhyay, K. et al. Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica // Antiviral Chemystry and Chemotherapy. –2007. –Vol.18, №3. –P.153162.14.
Семенов, А.В., Мазуров А.В., Преображенская М.Е. идр. Сульфатированные полисахариды как ингибиторы рецепторной активности Рселектинов и Рселектинового воспаления // Вопр. мед. химии. –1999. –т. 44, вып. 2. –С.135143. 15.
Ellouali, M., BoissonVidal, C., Durand , P., Jozefonvicz, J. Antitumoractivity of low molecular weight fucans extracted from brown seaweed Ascophyllum nodosum // Anticancer Res. –1993. –Vol.13. –P.20112019. 16.
Itoh, H., Noda, H., Amano, H. Antitumor activity and immunological properties of marine algal polysaccharides, especially fucoidan, prepared from Sargassum thunbergii of Phaeophyceae. // Anticancer Research. –1993. –Vol.13. –P.20452052. 17.
McClure, M.O., Moore, J.P., Blanc, D.F. Investigations into the mechanism by which sulfated polysaccharides inhibit HIV infection in vitro // AIDS Res. Hum. Retroviruses. –1992. –Vol.8. –P.1926. 18.
Макаренкова, И.Д., Компанец, Г.Г., Беседнова, Н.Н. идр. Скрининг биополимеров из морских гидробионтов, влияющих на адсорбцию вируса Хантаан // Вопросы вирусологии –2007. –№2. –С.2932. 19.19 Berteao O., Mullou B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide// Glycobiology. –2003. –Vol. 13, №6. –P. 2940 20.
Шевченко, Н.М. Строение, биологическая активность полисахаридов некоторых бурых водорослей и продуктов их ферментативной трансформации / дис. канд. хим. наук. —Владивосток, 2001. –91 с. 21.Патент РФ 2240816. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением препаратов для медицины и косметологии. 22.Колмакова, О.А., Пен, Р.З., Шапиро, И.Л., Бывшев, А.В., Тарабанько, В.Е. Низкотемпературная окислительная делигнификация древесины. Химические свойства пероксидной целлюлозы // Химия растительного сырья. –2003. –№1. –С. 39–43. 23.Урванцева, А.М., Бакунина И.Ю., Ким Н.Ю., Исаков В.В., Глазунов В.П., Звягинцева Т.Н. Выделение очищенного фукоидана из природного комплекса с полифенолами и его характеристика // Химия растительного сырья. –2004. –№3. –С. 15–24. 24.Bush, A., MartinPastor, M. Structure and conformation of complex carbohydrates of glycoproteins, glycolipids, and bacterial polysaccharides C // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1999 –V.28. –P.269293.
25.United States Patent 6,235,313. Bioadhesive microspheres and their use as drug delivery and imaging systems.26.ПатентРФ2145498 Фармацевтический состав, содержащий нанокапсулы, и способ его получения.
Suprunchuk Victoria E. Magistracy student of the first year FGAOU VPO "NorthCaucasian Federal University", Stavropol vikasuprunchuk@gmail.com Polyelectrolyte complexes based on fucoidan and their derivatives Abstract:The article deals with polyelectrolyte complexes based on fucoidan, the possibility of their creation and characterization. This paper deals with methods for producing and purifying fucoidan, as well as some of the methods of chemical modificationKeywords: polyelectrolyte complexes, fucoidan, microparticles, chemical modification of polysaccharides.
