Влияние серотонина и окситоцина на скорость агглютинации эритроцитов у женщин на различных этапах репродуктивного процесса
ART 86395
Автор:
О.
М. Безмельцева
О.
М. Безмельцева Библиографическое описание статьи для цитирования:
Безмельцева
О.
М. Влияние серотонина и окситоцина на скорость агглютинации эритроцитов у женщин на различных этапах репродуктивного процесса // Научно-методический электронный журнал «Концепт». –
2016. – Т. 11. – С.
1841–1845. – URL:
http://e-koncept.ru/2016/86395.htm.
Аннотация. Оценивали серотонинореактивность и окситоцинореактивность эритроцитов венозной крови женщин по изменению времени начала их агглютинации, индуцированной Анти-D IgM – реагентом в присутствии серотонина, используемого в одной из концентраций (от 10–8 до 10–4 г/мл), или изогемагглютинирующей сывороткой в присутствии окситоцина в концентрациях от 10–6 до 10–2 МЕ/мл. Установлено, что серотонинореактивность и окситоцинореактивность эритроцитов у женщин зависит от этапа репродуктивного процесса. Этот феномен можно использовать при разработке методов прогноза преждевременных родов.
Ключевые слова:
беременность, роды, серотонин, окситоцин, серотониновые рецепторы, окситоциновые рецепторы, эритроциты
Текст статьи
Безмельцева Оксана Михайловна,магистрант 1 курса, кафедры Биологии ФГБОУ ПО «Вятский государственный гуманитарный университет», г. Кировoksana_bezmeltseva@mail.ru
Научный руководительЦиркин Виктор Иванович,доктор медицинских наук, профессор кафедрынормальной физиологии ГБОУ ПО«Казанский государственный медицинский университет», профессор кафедры биологии ФГБОУ ПО «Вятский государственный гуманитарный университет», г.Кировtsirkin@list.ru
Влияние серотонина и окситоцина на скорость агглютинации эритроцитов у женщин на различных этапах репродуктивного процесса
Аннотация.Оценивали серотонинореактивность и окситоцинореактивность эритроцитов венозной крови женщин по изменению времени начала их агглютинации, индуцированной АнтиDIgM
реагентом в присутствии серотонина,используемого в одной из концентраций (от 108до 104г/мл), илиизогемагглютинирующей сывороткой в присутствииокситоцинав концентрациях от 106до 102МЕ/мл. Установлено, что серотонинореакативность и окситоцинореактивность эритроцитов у женщин зависит от этапа репродуктивного процесса. Этот феномен можно использовать при разработке методов прогноза преждевременных родов.Ключевые слова: серотонин, окситоцин, серотониновые рецепторы, окситоциновые рецепторы, эритроциты, беременность, роды.
ВведениеРеакция агглютинации эритроцитов является одним из простых, быстрых и информативных методов определения существования на мембране эритроцитов рецепторов различных биологически активных веществ.На мембране эритроцитов содержатся рецепторные белки гликопротеины, к которым относится рецепторы многих гормонов [1, 2]. Показано, что изменение реакции агглютинации эритроцитов под влиянием адреналина или ацетихолина отражает адренореактивность и холинореактивность эритроцитов и указывает на наличиевмембране эритроцитов адренорецепторов и холинорецепторов [3, 4].Известно, что серотонин может синтезироваться в матке, втом числе в клетках эндометрия, в кучевых клетках фолликула, в плаценте, а также в клетках эмбриона и плода [5]. Серотонин, подобно окситоцину, является активатором сократительнойактивности миометрия беременных и рожающих женщин [68]. К концу беременности миометрий женщин приобретает высокую чувствительность к серотонину( вероятно, это связано с тем, что перед родами происходит экспрессия серотониновых рецепторов).В акушерстве серотонин применяютпри слабости родовой деятельности [6,8].Окситоцин является наиболее сильным и специфическим утеротропным средством. Чувствительность матки к этому гормону повышается по мере развития беременности, достигая максимума непосредственно перед родами или во время родов. Возможно, это обусловлено увеличением концентрации окситоциновых рецепторов (под влиянием эстрогенов) в миометрии [6].Отметим, что вопрос обучастии окситоцина и серотонина в активации матки у человека в родах остается открытым, так как многие исследователи не смогли выявить определенные изменения в содержании окситоцина и серотонина в крови при беременности и непосредственно в родах [6]. Поэтому возникает вопрос на каком сроке беременности появляются окситоциновые и серотониновые рецепторы в миоцитах матки и можно ли в клинических условиях оценить их наличие и эффективность активации.Исходя из представлений о том, что эритроциты отражают изменение эффективности активации альфаи бетаадренорецепторов и Мхолинорецепторов [911], мы предположили, что эритроциты могут отражать и содержание в тех или иных органах окситоциновых и серотониновых рецепторов.Цель настоящей работы:оценить влияние окситоцина и серотонина на скорость агглютинации эритроцитов у беременных и рожающих женщин, а также женщин с угрозой преждевременных родов по характеру изменения способности эритроцитов к агглютинации, индуцируемой естественными агглютининами, в частности, реагентом изосероклонаTMантиDIgM, под влиянием серотонина, используемого в концентрациях от 108до 104г/мл ииндуцируемой изогемагглютинирующей сывороткой в присутствии окситоцина в концентрациях от 106до 102МЕ/мл.Материал и методы исследования. В работе с окситоцином исследовали гепаринизированную кровь 30 женщин с неосложненным течением I, IIи IIIтриместров беременности (по 10 женщин), а также 10 рожениц (Iпериод неосложненных родов) и 10 беременных с угрозой преждевременных родов (УПР), не перешедших в преждевременныероды. Аналогично, в работе с серотонином исследовали гепаринизированную кровь 30 женщин с неосложненным течением I, IIи IIIтриместров беременности (по 10 женщин), а также 10 рожениц (Iпериод неосложненных родов), 10 беременных с угрозой преждевременных родов (УПР). Кровь получали с личного согласия исследуемых в Кировском областном перинатальномцентре(женская консультация; отделение патологии, родовое отделение), используя для этого вакуумные пробирки для забора венозной крови с Naгепарином, объемом 6 мл (фирма NingboGreetmedMedicalInstrumentsCo., LTD). У всех них по аналогии с методикой определения адренореактивности эритроцитов [9, 10, 11] определяли окситоцинореактивность [12] и серотонинореактивность по изменению времени начала скорости их агглютинации в присутствии окситоцина (106
102МЕ/мл) или серотонина (108104 г/мл) в сравнении с действием солевого раствора Кребса, который имел состав (мМ) NaCl
136; KCl
4,7; CaCl2
2,52; MgCl2
1,2; KH2PO4
0,6; NaHCO3 4,7; глюкоза 11; pH
7,4, на котором готовится окситоцин или серотонин (контроль). В работе использовали окситоцин фирмы Санитас (Литва) и серотонина гидрохлорид ( SIGMA). В исследованиях с окситоцином [9, 10, 11, 12] агглютинация эритроцитов индуцировалась изогемагглютинирующей сывороткой крови людей с Iгруппой крови (0, альфа, бета), а в работе с серотониномагглютинацию эритроцитов проводили с использованием изосероклонаТМ антиDIgM, или антиDIgMреагента (производство Фонда развития медицинских и биологических технологий «МеДиКлон», С.Петербург), который применяется при определении резус
принадлежности кровичеловека. Такая замена расширила возможность исследования, так как позволяла использовать кровь всех четырех групп крови резусположительных женщин.Ход исследования заключался в том, что на плоскость с помощью стеклянных глазных пипеток наносили три капли: 1) каплю гепаринизированной крови, 2) каплю раствора Кребса (контроль) или каплю окситоцина/серотонина в одной из исследуемых концентраций (опыт), 3) каплю изогемагглютинирующей сывороткой крови людей с Iгруппой крови (0, альфа, бета) (в работе с окситоцином) или изосероклонаТМантиDIgM, либо (при исследовании женщин с резусотрицательной II, IIIили IVгруппами крови) цоликлона антиАВ (производство ООО «Гематолог», Москва) (в работе с серотонином). Затем смешивали стеклянной палочкой первую и вторую капли, а через 10 секунд к ним примешивали каплю изогемагглютинирующей сыворотки,изосероклонаТМили цоликлона антиАВ и с этого момента определяли время начала агглютинации (ВНА) эритроцитов по появлению ее первых визуальных признаков.Все результаты обработаны с использованием методов вариационной статистики. Хотя во многих группах распределение вариантов, судя по критерию ШапироУилка, который разработан специально для проверки нормальности малых выборок [13], было близко к нормальному, тем не менее, результаты исследования выражали в виде медианы, а также 25 и 75 центилей, чтобы не допустить ошибок при анализе тех распределений, у которых нормальность, по какимлибо причинам была отклонена. При этом различия с контролем оценивали по непараметрическомукритерию Уилкоксона (У) [14],используемого для зависимых выборок, а различия между группами оценивали по критерию МанаУитни (МУ), используемого при сравнении независимых выборок. В обеих случаях различия считали статистически значимы (*) при р<0,05.Результаты исследованияи их обсуждение.1. Влияние окситоцина на скорость агглютинации эритроцитов.Установлено (табл.1), что в условиях раствора Кребса ВНА эритроцитов, судя по значениям медианы, составляет 810с.Таблица 1Время начала агглютинации эритроцитов женщин (медиана, 25 и 75 центили) в присутствии раствора Кребса (с) или окситоцина (106
102МЕ/мл; в % от контроля, т.е. в присутствие раствора Кребса).
Концентрация окситоцина, МЕ/млКонтроль, (раствор Кребса), с 106105104103102Группа 1беременные, Iтриместр (8 12 недель; n=10)10,0(9; 13,5)113,0(105; 145)117,5(102; 131,5)117,5*
(104; 140)111,5*
(107; 134,5)119,5(97; 165,5)Группа 2беременные, IIтриместр (13 24 недели; n=10)9,0(9; 11,5)91,5
(88,5; 111)100,0(82; 111)100,01
(90,5; 116,5)100,0 1(94,5; 118)94,0 1(85,5; 116,5)Группа 3беременные IIIтриместр (25 38 недели; n=10)10,0(9; 13)89,0 (77,5; 127,5)105,0 (90; 112)100,0 2(91; 121)100,0(88; 124)104,0(100;144)Группа 4 роженицы, (38 40 недель, латентная фаза Iпериода родов; n=10)9,5(6,5; 14,5)96,0(88,5; 124)100,0(97,0; 136,0)100,0(91,5; 131,5)103,0(100; 123,5)118,0*(104; 140,5)Группа 5 беременные с угрозой преждевременных родов (24 36 недель; n=10)8,0(7,5; 15,5)100,0(90; 113,5)115,5(97,5; 127)111,0(91,5; 153)100,0(91,5; 129)104,0(94; 138,5)Примечания: * различия с контролем статистически значимы (p0,05) по критерию Вилкоксона.1 или2
различиес группой 1 или 2статистически значимо, по критерию МанаУитни (p0,05).
ВНА эритроцитов женщин в Iм триместре беременности при действии окситоцина в концентрациях 106,…, 102МЕ/млсоставило соответственно 113,0%, 117,5%, 117,5%*, 111,5%*
и 119,5% от контроля. Это означает, что окситоцин во всех концентрациях повышает ВНА, причем статистически значимо в концентрациях 104и103 МЕ/мл. Т.е. в Iтриместре беременности окситоцин снижает скорость агглютинации эритроцитов. Это означает, что эритроциты женщин в Iтриместре чувствительны к окситоцину.ВНА эритроцитов женщин в IIтриместре беременности при действии окситоцина в концентрациях 106,…, 102МЕ/мл составило соответственно 91,5%, 100,0%, 100,0%, 100,0% и 94,0% от контроля, а у женщин в IIIтриместре беременности
соответственно 89,0%, 105,0%, 100,0%, 100,0% и 104,0% от контроля. При этом все изменения были статистически незначимы (р>0,05 по критерию Уилкоксона). Таким образом, во IIтриместре беременности эритроциты утрачивают чувствительность к окситоцину, т.е. становятся рефрактерны к нему и сохраняют такое состояние в IIIтриместре.
ВНА эритроцитов рожениц (латентная фаза Iпериода неосложненных родов) при действии окситоцина в концентрациях 106,…, 102МЕ/мл составило соответственно 96,0%, 100,0%, 100,0%, 103,0% и 118,0%* от контроля. Это означает, что в родах окситоцин в концентрации 102МЕ/мл статистически значимо увеличивает ВНА (р<0,05 по критерию Уилкоксона), т.е. снижает скорость агглютинации. Таким образом, в родах эритроциты вновь приобретают чувствительность к окситоцину. Вопрос о том, за сколько суток до начала срочных родов эритроцит утрачивает рефрактерностьк окситоцину и приобретает чувствительность к нему как к фактору, уменьшающему скорость агглютинации, требует отдельного исследования.
ВНА эритроцитов женщин с угрозой преждевременных родов при действии окситоцина в концентрации 106,…, 102МЕ/млсоставило соответственно 100,0%, 115,5%, 111,0%, 100,0% и 104,0% от контроля. При этом все изменения статистически незначимы (р>0,05 по критерию Уилкоксона). Это означает, что при угрозе преждевременных родов эритроциты остаются такими же рефрактерными к окситоцину, как и эритроциты женщин с неосложненным течением беременности. Не исключено, что при переходе к преждевременным родам эритроциты станут окситоцинореактивными, т.е. подобно женщин при срочных родах их эритроциты будут снижать скорость агглютинации под влиянием окситоцина. С этих позиций полагаем, что оценка окситоцинореактивности эритроцитов может быть информативным тестом при диагностике и при лечении угрозы преждевременных родов, выполнимым в условиях женской консультации и акушерскогинекологическогостационара. Относительная простата метода, его высокая скорость получения результата исследования позволяет надеяться, что метод оценки окситоцинореактивности эритроцитов по изменению их скорости агглютинации будет востребован вакушерстве.2. Влияние серотонина на скорость агглютинации эритроцитов.Установлено (табл.2), что в условиях раствора Кребса ВНА эритроцитов варьировало от 7с до 23с, независимо от этапа репродукции. Это соответствует данным, полученным ранее в нашей лаборатории [9; 10; 11; 12].Таблица 2Время начала агглютинации эритроцитов беременных женщин, рожениц и женщин с угрозой преждевременных родов (медиана, 25 и 75 центили) в присутствии раствора Кребса (с, контроль) или серотонина (108
104г/мл, в % от контроля).Контроль (растворКребса), сКонцентрация серотонина, г/мл108107106105104
1 группа беременные, I триместр (611 недель; n=10)16,0(14,0; 19,0)86,5 *(80,0; 90,5)80,5*(77,5; 89,0)82,5*(79,0; 96,5)85,5(80,0; 100,0)85,5(75,0; 119,5)2 группа беременные, II триместр (12,526 недель; n=10)11,5(9,5; 17,5)97,0(80,0; 115,0)90,5 1(87,0; 109,5)97,0 1(92,0; 117,0)98,5(89,5; 121,0)111,0 (98,0; 122,0)3 группа беременные, III триместр (2838 недель; n=10)11,0(10,5; 15,5)81,0(74,0; 118,0)80,5*(73,0; 104,5)96,5(74,0; 119,0)92,0(74,0; 105,0)87,0 *2(80,0; 90,5)4 группа роженицы, Iпериод неосложненных родов (n=10)11,0(9,0; 13,0)78,5*(75,0; 105,0)86,5*(78,5; 96,5)100,0(85,0; 110,5)100,0 1(96,5; 114,0)108,0 3(100,0; 121,0) 5 группа женщины с угрозой преждевременных родов (2231 недели беременности, n=10)10,0(7,5; 12,5)84,0(64,5; 115,0)93,0(65,0; 118,5)89,0(76,0; 116,5)91,5(76,0; 116,5)87,0(79,0; 126,5)
* различия с контролем статистически значимы (p<0,05) по критерию Уилкоксона.
1,2,3
различие соответствующей группойстатистически значимопо критерию МанаУитни (p,05).
ВНА эритроцитов женщин в Iм триместре беременности при действии серотонина (108,…, 104г/мл)составило соответственно 86,5%*, 80,5%*, 82,5%*, 85,5% и 85,5% от контроля. При этом статистически значимо (р<0,05) серотонин понижает ВНА в концентрациях 108, 107 и106 г/мл, т.е. повышает скорость агглютинации эритроцитов. Изменения ВНА эритроцитов под влиянием серотонина в концентрациях 105 и104 г/мл были статистически незначимы (р>0,05). В целом, эти данные позволяют заключить, что в Iтриместре беременности эритроциты чувствительны к серотонину, что проявляется в повышении их скорости агглютинации под влиянием серотонина в концентрациях 108, 107 и106 г/мл.
Показано, что ВНА эритроцитов женщин в IIтриместре беременности при действии серотонина во всех исследованных нами концентраций (108,…, 104г/мл)не менялось все изменения, равные соответственно 97,0%, 90,5%, 97,0%, 98,5% и 111,0% от контроля, были статистически незначимы. Косвенно, это означает, что во IIтриместре физиологически протекающей беременности эритроциты утрачивают серотонинореактивность, т.е. они становятся рефрактерными к нему.У женщин в IIIтриместре беременности ВНА эритроцитов под влияниемсеротонина статистически значимо (р<0,05) снижается при его использовании в концентрациях 107и 104 г/мл соответственно до 80,5%
и до 87,0%от контроля. Изменения ВНА под влиянием серотонина в концентрациях 108, 106 и 105 г/мл (соответственно 81,0%, 96,5% и 92,0% от контроля) были статистически незначимы. Следовательно, во IIIтриместре беременности эритроциты вновь приобретает чувствительность к серотонину.Показано, что у рожениц (латентная фаза Iпериода неосложненных родов) ВНА эритроцитовстатистически значимо (р<0,05) снижается под влиянием серотонина при его использовании в концентрациях 108 и 107г/мл (соответственно до 78,5% и до 86,5% от контроля). Изменения ВНА под влиянием серотонина в концентрациях 106, 105 и 104 г/мл, равные соответственно 100,0%, 100,0% и 108,0% от контроля, были статистически незначимы. В целом, это означает, что в Iпериоде родов эритроциты чувствительны к серотонину.Отсутствие подобной зависимости для более высоких концентраций серотонина и даже появление у серотонина (104г/мл) тенденции к повышению ВНА (до 108% от контроля), т.е. к снижению скорости агглютинации позволяет предположить, что в родах в эритроцитах помимо популяции рецепторов, активация которых повышает скорость агглютинации, появляется популяция серотониновых рецепторов, активация которых снижает скорость агглютинации.Установлено, что у женщин с УПРсеротонин ни в одной из концентраций (108104г/мл) не вызывает изменения ВНА все значения этого показателя (соответственно 84,0%, 93,0%, 89,0%, 91,5% и 87,0% от контроля) были статистически незначимы. Это означает, что при УПР эритроциты не повышают свою серотонинореактивность. Косвенно, это говорит о том, что при угрозе преждевременных родов, которая не перешла в преждевременные роды, эритроциты не способны отвечать на серотонин изменением скорости агглютинации. Следовательно, оценка серотонинореактивности эритроцитов, определяемая по изменению ВНА эритроцитов, может быть использована в качестве экспресстеста при определении времени наступления срочных родов и для прогнозирования вероятности перехода УПР в преждевременные роды.Заключение.Так как реакция агглютинации эритроцитов является одним из простых, быстрых и информативных методов определения существования на мембране эритроцитов рецепторов различных биологически активных веществ [2], в нашей работе была поставлена цель оценить реактивность эритроцитов к окситоцину и серотонину, что косвенно позволяет говорить о наличии или отсутствии мембране эритроцитасоответственноокситоциновыхилисеротониновых рецепторовпорезультатам исследования можно сделать следующие выводы:1. Эритроцитыбеременныхженщин содержат окситоциновые и серотониновые рецепторы, приэтом активацияокситоциновых рецепторовповышает скорость агглютинации эритроцитов, а активация серотониновых рецепторов снижаетее.2. Выраженность окситоциновых и серотониновых рецепторов, судя по статистически значимому изменению скорости агглютинации эритроцитов, определяетсяэтапом репродуктивного процесса. В частности, онивыражены в Iтриместре беременности, отсутствуют во IIтриместре, а также (это характерно для окситоциновых рецепторов,но не для серотониновых) в IIIтриместре и вновь проявляют свое наличие в эритроцитах рожениц. Это означает, что накануне родов реакция эритроцитов на окситоцин и на серотонин, т.е. их окситоциноерактивность и серотонинореактивность восстанавливается (вероятно, реакция на серотонин раньше) и сохраняется в родах. Это означает, что эритроциты женщинмогут отражать экспрессию окситоциновых и серотониновых рецепторов в миометрии и тем самым отражать готовность организма матери к родам.3. При угрозе преждевременных родов, не перешедших в преждевременные роды, окситоцин (106
102МЕ/мл)и серотонин (108104 г/мл) невлияют на скорость агглютинации эритроцитов, т.е. эритроциты сохраняют рефрактерность к окситоцину и серотонину. Это означает, что оценка окситоцинореактивности и серотонинореактивностиэритроцитов(по изменению скорости их агглютинации) может использоваться в акушерстве с целью прогноза исходаугрозы преждевременных родов, а также дляопределения срока наступления срочных родов.
Ссылки на источники1.Гликопротеины [Электронный ресурс]. Режим доступа : https://ru.wikipedia.org/wiki/Гликопротеины2.Смирнов, В. М. Нормальная физиология : учебник для студ. высш. мед. проф. образования [Текст] / [Н. А. Агаджанян, Н. А. Барбараш, А. Ф. Белов и др.]; под ред. В. М. Смирнова. ‒4е изд., испр. М. : Издательский центр «Академия», 2012. 480 с.3.Володченко, А. И. Адренореактивность эритроцитов, определяемая по их адренозависимой агглютинации, у женщин на различных этапах репродуктивного процесса [Текст] / А. И. Володченко, В. И. Циркин, С. В. Хлыбова, С. Л. Дмитриева // Вятский медицинский вестник. 2013. № 1. С. 2531.4.Циркин, В. И. Адренои Мхолинореактивность эритроцитов женщин на протяжении репродуктивного процесса [Текст] / В. И. Циркин, А.И. Володченко, С. В. Хлыбова, С.Л. Дмитриева, О. А. Братухина //Вестник северного (арктического) федерального университета. Серия: медикобиологические науки. 2014. № 2. С. 7890.5.Darios, E. Smooth muscle pharmacology in the isolated virgin and pregnant rat uterus and cervix [Текст] / E. Darios, B. Seitz, S. Watts // J Pharmacol Exp Ther. 2012. Vol. 341, № 3. Р. 587596.6.Циркин, В. И. Сократительная деятельность матки (механизм регуляции) [Текст] / В. И. Циркин, С. А. Дворянский. Киров, 1997. 270 с.7.Cordeaux, Y. Characterization of serotonin receptors in pregnant human myometrium [Текст] / Y. Cordeaux, D. Pasupathy, J. Bacon, D. S. CharnockJones, G. C. Smith // J Pharmacol Exp Ther. 2009. Vol. 328, № 3. Р. 682691.8.Курский,М.Д. Биохимические основы механизма действия серотонина [Текст] / М. Д. Курский, Н. С. Бакшеев. Киев: Издво Наукова думка, 1974. 296 с.9.Володченко, А.И. Механизм изменения скорости агглютинации эритроцитов человека под влиянием адреналина [Текст] / А. И. Володченко, В. И. Циркин, А. А. Костяев // Физиология человека. 2014. Т. 40, № 2. С. 6774.10.Володченко, А.И. Изменение скорости адренозависимой агглютинации эритроцитов у женщин на различных этапах репродуктивного процесса [Текст] / А. И. Володченко, В.И. Циркин, С. В. Хлыбова, С. Л. Дмитриева // Российский вестник акушерагинеколога. 2013. Т. 13, № 6. С. 1015.11.Циркин, В.И. Механизм повышения скорости агглютинации эритроцитов человека под влиянием адреналина и его связь с эритроцитозом [Текст] /В. И. Циркин, А. Д. Ноздрачев, А. И. Володченко // Доклады Академии наук. 2013. Т. 451, № 4. С. 464467.12.Безмельцева, О. М. Влияние окситоцина на скорость агглютинации эритроцитов человека, индуцированной изогемагглютинирующей сывороткой [Текст] / О. М. Безмельцева [и др.] // Медицинский альманах. 2014, № 5. С. 7174.13.Критерий ШапироУилка. Режим доступа :http://www.nsu.ru/mmf/tvims/arkashov/calc/Stat/Shapiro/Shapiro.html14.Гланц, С. Медикобиологическая статистика [Текст] / С. Гланц; пер. с англ.М., Практика, 1999. 459 с.
Научный руководительЦиркин Виктор Иванович,доктор медицинских наук, профессор кафедрынормальной физиологии ГБОУ ПО«Казанский государственный медицинский университет», профессор кафедры биологии ФГБОУ ПО «Вятский государственный гуманитарный университет», г.Кировtsirkin@list.ru
Влияние серотонина и окситоцина на скорость агглютинации эритроцитов у женщин на различных этапах репродуктивного процесса
Аннотация.Оценивали серотонинореактивность и окситоцинореактивность эритроцитов венозной крови женщин по изменению времени начала их агглютинации, индуцированной АнтиDIgM
реагентом в присутствии серотонина,используемого в одной из концентраций (от 108до 104г/мл), илиизогемагглютинирующей сывороткой в присутствииокситоцинав концентрациях от 106до 102МЕ/мл. Установлено, что серотонинореакативность и окситоцинореактивность эритроцитов у женщин зависит от этапа репродуктивного процесса. Этот феномен можно использовать при разработке методов прогноза преждевременных родов.Ключевые слова: серотонин, окситоцин, серотониновые рецепторы, окситоциновые рецепторы, эритроциты, беременность, роды.
ВведениеРеакция агглютинации эритроцитов является одним из простых, быстрых и информативных методов определения существования на мембране эритроцитов рецепторов различных биологически активных веществ.На мембране эритроцитов содержатся рецепторные белки гликопротеины, к которым относится рецепторы многих гормонов [1, 2]. Показано, что изменение реакции агглютинации эритроцитов под влиянием адреналина или ацетихолина отражает адренореактивность и холинореактивность эритроцитов и указывает на наличиевмембране эритроцитов адренорецепторов и холинорецепторов [3, 4].Известно, что серотонин может синтезироваться в матке, втом числе в клетках эндометрия, в кучевых клетках фолликула, в плаценте, а также в клетках эмбриона и плода [5]. Серотонин, подобно окситоцину, является активатором сократительнойактивности миометрия беременных и рожающих женщин [68]. К концу беременности миометрий женщин приобретает высокую чувствительность к серотонину( вероятно, это связано с тем, что перед родами происходит экспрессия серотониновых рецепторов).В акушерстве серотонин применяютпри слабости родовой деятельности [6,8].Окситоцин является наиболее сильным и специфическим утеротропным средством. Чувствительность матки к этому гормону повышается по мере развития беременности, достигая максимума непосредственно перед родами или во время родов. Возможно, это обусловлено увеличением концентрации окситоциновых рецепторов (под влиянием эстрогенов) в миометрии [6].Отметим, что вопрос обучастии окситоцина и серотонина в активации матки у человека в родах остается открытым, так как многие исследователи не смогли выявить определенные изменения в содержании окситоцина и серотонина в крови при беременности и непосредственно в родах [6]. Поэтому возникает вопрос на каком сроке беременности появляются окситоциновые и серотониновые рецепторы в миоцитах матки и можно ли в клинических условиях оценить их наличие и эффективность активации.Исходя из представлений о том, что эритроциты отражают изменение эффективности активации альфаи бетаадренорецепторов и Мхолинорецепторов [911], мы предположили, что эритроциты могут отражать и содержание в тех или иных органах окситоциновых и серотониновых рецепторов.Цель настоящей работы:оценить влияние окситоцина и серотонина на скорость агглютинации эритроцитов у беременных и рожающих женщин, а также женщин с угрозой преждевременных родов по характеру изменения способности эритроцитов к агглютинации, индуцируемой естественными агглютининами, в частности, реагентом изосероклонаTMантиDIgM, под влиянием серотонина, используемого в концентрациях от 108до 104г/мл ииндуцируемой изогемагглютинирующей сывороткой в присутствии окситоцина в концентрациях от 106до 102МЕ/мл.Материал и методы исследования. В работе с окситоцином исследовали гепаринизированную кровь 30 женщин с неосложненным течением I, IIи IIIтриместров беременности (по 10 женщин), а также 10 рожениц (Iпериод неосложненных родов) и 10 беременных с угрозой преждевременных родов (УПР), не перешедших в преждевременныероды. Аналогично, в работе с серотонином исследовали гепаринизированную кровь 30 женщин с неосложненным течением I, IIи IIIтриместров беременности (по 10 женщин), а также 10 рожениц (Iпериод неосложненных родов), 10 беременных с угрозой преждевременных родов (УПР). Кровь получали с личного согласия исследуемых в Кировском областном перинатальномцентре(женская консультация; отделение патологии, родовое отделение), используя для этого вакуумные пробирки для забора венозной крови с Naгепарином, объемом 6 мл (фирма NingboGreetmedMedicalInstrumentsCo., LTD). У всех них по аналогии с методикой определения адренореактивности эритроцитов [9, 10, 11] определяли окситоцинореактивность [12] и серотонинореактивность по изменению времени начала скорости их агглютинации в присутствии окситоцина (106
102МЕ/мл) или серотонина (108104 г/мл) в сравнении с действием солевого раствора Кребса, который имел состав (мМ) NaCl
136; KCl
4,7; CaCl2
2,52; MgCl2
1,2; KH2PO4
0,6; NaHCO3 4,7; глюкоза 11; pH
7,4, на котором готовится окситоцин или серотонин (контроль). В работе использовали окситоцин фирмы Санитас (Литва) и серотонина гидрохлорид ( SIGMA). В исследованиях с окситоцином [9, 10, 11, 12] агглютинация эритроцитов индуцировалась изогемагглютинирующей сывороткой крови людей с Iгруппой крови (0, альфа, бета), а в работе с серотониномагглютинацию эритроцитов проводили с использованием изосероклонаТМ антиDIgM, или антиDIgMреагента (производство Фонда развития медицинских и биологических технологий «МеДиКлон», С.Петербург), который применяется при определении резус
принадлежности кровичеловека. Такая замена расширила возможность исследования, так как позволяла использовать кровь всех четырех групп крови резусположительных женщин.Ход исследования заключался в том, что на плоскость с помощью стеклянных глазных пипеток наносили три капли: 1) каплю гепаринизированной крови, 2) каплю раствора Кребса (контроль) или каплю окситоцина/серотонина в одной из исследуемых концентраций (опыт), 3) каплю изогемагглютинирующей сывороткой крови людей с Iгруппой крови (0, альфа, бета) (в работе с окситоцином) или изосероклонаТМантиDIgM, либо (при исследовании женщин с резусотрицательной II, IIIили IVгруппами крови) цоликлона антиАВ (производство ООО «Гематолог», Москва) (в работе с серотонином). Затем смешивали стеклянной палочкой первую и вторую капли, а через 10 секунд к ним примешивали каплю изогемагглютинирующей сыворотки,изосероклонаТМили цоликлона антиАВ и с этого момента определяли время начала агглютинации (ВНА) эритроцитов по появлению ее первых визуальных признаков.Все результаты обработаны с использованием методов вариационной статистики. Хотя во многих группах распределение вариантов, судя по критерию ШапироУилка, который разработан специально для проверки нормальности малых выборок [13], было близко к нормальному, тем не менее, результаты исследования выражали в виде медианы, а также 25 и 75 центилей, чтобы не допустить ошибок при анализе тех распределений, у которых нормальность, по какимлибо причинам была отклонена. При этом различия с контролем оценивали по непараметрическомукритерию Уилкоксона (У) [14],используемого для зависимых выборок, а различия между группами оценивали по критерию МанаУитни (МУ), используемого при сравнении независимых выборок. В обеих случаях различия считали статистически значимы (*) при р<0,05.Результаты исследованияи их обсуждение.1. Влияние окситоцина на скорость агглютинации эритроцитов.Установлено (табл.1), что в условиях раствора Кребса ВНА эритроцитов, судя по значениям медианы, составляет 810с.Таблица 1Время начала агглютинации эритроцитов женщин (медиана, 25 и 75 центили) в присутствии раствора Кребса (с) или окситоцина (106
102МЕ/мл; в % от контроля, т.е. в присутствие раствора Кребса).
Концентрация окситоцина, МЕ/млКонтроль, (раствор Кребса), с 106105104103102Группа 1беременные, Iтриместр (8 12 недель; n=10)10,0(9; 13,5)113,0(105; 145)117,5(102; 131,5)117,5*
(104; 140)111,5*
(107; 134,5)119,5(97; 165,5)Группа 2беременные, IIтриместр (13 24 недели; n=10)9,0(9; 11,5)91,5
(88,5; 111)100,0(82; 111)100,01
(90,5; 116,5)100,0 1(94,5; 118)94,0 1(85,5; 116,5)Группа 3беременные IIIтриместр (25 38 недели; n=10)10,0(9; 13)89,0 (77,5; 127,5)105,0 (90; 112)100,0 2(91; 121)100,0(88; 124)104,0(100;144)Группа 4 роженицы, (38 40 недель, латентная фаза Iпериода родов; n=10)9,5(6,5; 14,5)96,0(88,5; 124)100,0(97,0; 136,0)100,0(91,5; 131,5)103,0(100; 123,5)118,0*(104; 140,5)Группа 5 беременные с угрозой преждевременных родов (24 36 недель; n=10)8,0(7,5; 15,5)100,0(90; 113,5)115,5(97,5; 127)111,0(91,5; 153)100,0(91,5; 129)104,0(94; 138,5)Примечания: * различия с контролем статистически значимы (p0,05) по критерию Вилкоксона.1 или2
различиес группой 1 или 2статистически значимо, по критерию МанаУитни (p0,05).
ВНА эритроцитов женщин в Iм триместре беременности при действии окситоцина в концентрациях 106,…, 102МЕ/млсоставило соответственно 113,0%, 117,5%, 117,5%*, 111,5%*
и 119,5% от контроля. Это означает, что окситоцин во всех концентрациях повышает ВНА, причем статистически значимо в концентрациях 104и103 МЕ/мл. Т.е. в Iтриместре беременности окситоцин снижает скорость агглютинации эритроцитов. Это означает, что эритроциты женщин в Iтриместре чувствительны к окситоцину.ВНА эритроцитов женщин в IIтриместре беременности при действии окситоцина в концентрациях 106,…, 102МЕ/мл составило соответственно 91,5%, 100,0%, 100,0%, 100,0% и 94,0% от контроля, а у женщин в IIIтриместре беременности
соответственно 89,0%, 105,0%, 100,0%, 100,0% и 104,0% от контроля. При этом все изменения были статистически незначимы (р>0,05 по критерию Уилкоксона). Таким образом, во IIтриместре беременности эритроциты утрачивают чувствительность к окситоцину, т.е. становятся рефрактерны к нему и сохраняют такое состояние в IIIтриместре.
ВНА эритроцитов рожениц (латентная фаза Iпериода неосложненных родов) при действии окситоцина в концентрациях 106,…, 102МЕ/мл составило соответственно 96,0%, 100,0%, 100,0%, 103,0% и 118,0%* от контроля. Это означает, что в родах окситоцин в концентрации 102МЕ/мл статистически значимо увеличивает ВНА (р<0,05 по критерию Уилкоксона), т.е. снижает скорость агглютинации. Таким образом, в родах эритроциты вновь приобретают чувствительность к окситоцину. Вопрос о том, за сколько суток до начала срочных родов эритроцит утрачивает рефрактерностьк окситоцину и приобретает чувствительность к нему как к фактору, уменьшающему скорость агглютинации, требует отдельного исследования.
ВНА эритроцитов женщин с угрозой преждевременных родов при действии окситоцина в концентрации 106,…, 102МЕ/млсоставило соответственно 100,0%, 115,5%, 111,0%, 100,0% и 104,0% от контроля. При этом все изменения статистически незначимы (р>0,05 по критерию Уилкоксона). Это означает, что при угрозе преждевременных родов эритроциты остаются такими же рефрактерными к окситоцину, как и эритроциты женщин с неосложненным течением беременности. Не исключено, что при переходе к преждевременным родам эритроциты станут окситоцинореактивными, т.е. подобно женщин при срочных родах их эритроциты будут снижать скорость агглютинации под влиянием окситоцина. С этих позиций полагаем, что оценка окситоцинореактивности эритроцитов может быть информативным тестом при диагностике и при лечении угрозы преждевременных родов, выполнимым в условиях женской консультации и акушерскогинекологическогостационара. Относительная простата метода, его высокая скорость получения результата исследования позволяет надеяться, что метод оценки окситоцинореактивности эритроцитов по изменению их скорости агглютинации будет востребован вакушерстве.2. Влияние серотонина на скорость агглютинации эритроцитов.Установлено (табл.2), что в условиях раствора Кребса ВНА эритроцитов варьировало от 7с до 23с, независимо от этапа репродукции. Это соответствует данным, полученным ранее в нашей лаборатории [9; 10; 11; 12].Таблица 2Время начала агглютинации эритроцитов беременных женщин, рожениц и женщин с угрозой преждевременных родов (медиана, 25 и 75 центили) в присутствии раствора Кребса (с, контроль) или серотонина (108
104г/мл, в % от контроля).Контроль (растворКребса), сКонцентрация серотонина, г/мл108107106105104
1 группа беременные, I триместр (611 недель; n=10)16,0(14,0; 19,0)86,5 *(80,0; 90,5)80,5*(77,5; 89,0)82,5*(79,0; 96,5)85,5(80,0; 100,0)85,5(75,0; 119,5)2 группа беременные, II триместр (12,526 недель; n=10)11,5(9,5; 17,5)97,0(80,0; 115,0)90,5 1(87,0; 109,5)97,0 1(92,0; 117,0)98,5(89,5; 121,0)111,0 (98,0; 122,0)3 группа беременные, III триместр (2838 недель; n=10)11,0(10,5; 15,5)81,0(74,0; 118,0)80,5*(73,0; 104,5)96,5(74,0; 119,0)92,0(74,0; 105,0)87,0 *2(80,0; 90,5)4 группа роженицы, Iпериод неосложненных родов (n=10)11,0(9,0; 13,0)78,5*(75,0; 105,0)86,5*(78,5; 96,5)100,0(85,0; 110,5)100,0 1(96,5; 114,0)108,0 3(100,0; 121,0) 5 группа женщины с угрозой преждевременных родов (2231 недели беременности, n=10)10,0(7,5; 12,5)84,0(64,5; 115,0)93,0(65,0; 118,5)89,0(76,0; 116,5)91,5(76,0; 116,5)87,0(79,0; 126,5)
* различия с контролем статистически значимы (p<0,05) по критерию Уилкоксона.
1,2,3
различие соответствующей группойстатистически значимопо критерию МанаУитни (p,05).
ВНА эритроцитов женщин в Iм триместре беременности при действии серотонина (108,…, 104г/мл)составило соответственно 86,5%*, 80,5%*, 82,5%*, 85,5% и 85,5% от контроля. При этом статистически значимо (р<0,05) серотонин понижает ВНА в концентрациях 108, 107 и106 г/мл, т.е. повышает скорость агглютинации эритроцитов. Изменения ВНА эритроцитов под влиянием серотонина в концентрациях 105 и104 г/мл были статистически незначимы (р>0,05). В целом, эти данные позволяют заключить, что в Iтриместре беременности эритроциты чувствительны к серотонину, что проявляется в повышении их скорости агглютинации под влиянием серотонина в концентрациях 108, 107 и106 г/мл.
Показано, что ВНА эритроцитов женщин в IIтриместре беременности при действии серотонина во всех исследованных нами концентраций (108,…, 104г/мл)не менялось все изменения, равные соответственно 97,0%, 90,5%, 97,0%, 98,5% и 111,0% от контроля, были статистически незначимы. Косвенно, это означает, что во IIтриместре физиологически протекающей беременности эритроциты утрачивают серотонинореактивность, т.е. они становятся рефрактерными к нему.У женщин в IIIтриместре беременности ВНА эритроцитов под влияниемсеротонина статистически значимо (р<0,05) снижается при его использовании в концентрациях 107и 104 г/мл соответственно до 80,5%
и до 87,0%от контроля. Изменения ВНА под влиянием серотонина в концентрациях 108, 106 и 105 г/мл (соответственно 81,0%, 96,5% и 92,0% от контроля) были статистически незначимы. Следовательно, во IIIтриместре беременности эритроциты вновь приобретает чувствительность к серотонину.Показано, что у рожениц (латентная фаза Iпериода неосложненных родов) ВНА эритроцитовстатистически значимо (р<0,05) снижается под влиянием серотонина при его использовании в концентрациях 108 и 107г/мл (соответственно до 78,5% и до 86,5% от контроля). Изменения ВНА под влиянием серотонина в концентрациях 106, 105 и 104 г/мл, равные соответственно 100,0%, 100,0% и 108,0% от контроля, были статистически незначимы. В целом, это означает, что в Iпериоде родов эритроциты чувствительны к серотонину.Отсутствие подобной зависимости для более высоких концентраций серотонина и даже появление у серотонина (104г/мл) тенденции к повышению ВНА (до 108% от контроля), т.е. к снижению скорости агглютинации позволяет предположить, что в родах в эритроцитах помимо популяции рецепторов, активация которых повышает скорость агглютинации, появляется популяция серотониновых рецепторов, активация которых снижает скорость агглютинации.Установлено, что у женщин с УПРсеротонин ни в одной из концентраций (108104г/мл) не вызывает изменения ВНА все значения этого показателя (соответственно 84,0%, 93,0%, 89,0%, 91,5% и 87,0% от контроля) были статистически незначимы. Это означает, что при УПР эритроциты не повышают свою серотонинореактивность. Косвенно, это говорит о том, что при угрозе преждевременных родов, которая не перешла в преждевременные роды, эритроциты не способны отвечать на серотонин изменением скорости агглютинации. Следовательно, оценка серотонинореактивности эритроцитов, определяемая по изменению ВНА эритроцитов, может быть использована в качестве экспресстеста при определении времени наступления срочных родов и для прогнозирования вероятности перехода УПР в преждевременные роды.Заключение.Так как реакция агглютинации эритроцитов является одним из простых, быстрых и информативных методов определения существования на мембране эритроцитов рецепторов различных биологически активных веществ [2], в нашей работе была поставлена цель оценить реактивность эритроцитов к окситоцину и серотонину, что косвенно позволяет говорить о наличии или отсутствии мембране эритроцитасоответственноокситоциновыхилисеротониновых рецепторовпорезультатам исследования можно сделать следующие выводы:1. Эритроцитыбеременныхженщин содержат окситоциновые и серотониновые рецепторы, приэтом активацияокситоциновых рецепторовповышает скорость агглютинации эритроцитов, а активация серотониновых рецепторов снижаетее.2. Выраженность окситоциновых и серотониновых рецепторов, судя по статистически значимому изменению скорости агглютинации эритроцитов, определяетсяэтапом репродуктивного процесса. В частности, онивыражены в Iтриместре беременности, отсутствуют во IIтриместре, а также (это характерно для окситоциновых рецепторов,но не для серотониновых) в IIIтриместре и вновь проявляют свое наличие в эритроцитах рожениц. Это означает, что накануне родов реакция эритроцитов на окситоцин и на серотонин, т.е. их окситоциноерактивность и серотонинореактивность восстанавливается (вероятно, реакция на серотонин раньше) и сохраняется в родах. Это означает, что эритроциты женщинмогут отражать экспрессию окситоциновых и серотониновых рецепторов в миометрии и тем самым отражать готовность организма матери к родам.3. При угрозе преждевременных родов, не перешедших в преждевременные роды, окситоцин (106
102МЕ/мл)и серотонин (108104 г/мл) невлияют на скорость агглютинации эритроцитов, т.е. эритроциты сохраняют рефрактерность к окситоцину и серотонину. Это означает, что оценка окситоцинореактивности и серотонинореактивностиэритроцитов(по изменению скорости их агглютинации) может использоваться в акушерстве с целью прогноза исходаугрозы преждевременных родов, а также дляопределения срока наступления срочных родов.
Ссылки на источники1.Гликопротеины [Электронный ресурс]. Режим доступа : https://ru.wikipedia.org/wiki/Гликопротеины2.Смирнов, В. М. Нормальная физиология : учебник для студ. высш. мед. проф. образования [Текст] / [Н. А. Агаджанян, Н. А. Барбараш, А. Ф. Белов и др.]; под ред. В. М. Смирнова. ‒4е изд., испр. М. : Издательский центр «Академия», 2012. 480 с.3.Володченко, А. И. Адренореактивность эритроцитов, определяемая по их адренозависимой агглютинации, у женщин на различных этапах репродуктивного процесса [Текст] / А. И. Володченко, В. И. Циркин, С. В. Хлыбова, С. Л. Дмитриева // Вятский медицинский вестник. 2013. № 1. С. 2531.4.Циркин, В. И. Адренои Мхолинореактивность эритроцитов женщин на протяжении репродуктивного процесса [Текст] / В. И. Циркин, А.И. Володченко, С. В. Хлыбова, С.Л. Дмитриева, О. А. Братухина //Вестник северного (арктического) федерального университета. Серия: медикобиологические науки. 2014. № 2. С. 7890.5.Darios, E. Smooth muscle pharmacology in the isolated virgin and pregnant rat uterus and cervix [Текст] / E. Darios, B. Seitz, S. Watts // J Pharmacol Exp Ther. 2012. Vol. 341, № 3. Р. 587596.6.Циркин, В. И. Сократительная деятельность матки (механизм регуляции) [Текст] / В. И. Циркин, С. А. Дворянский. Киров, 1997. 270 с.7.Cordeaux, Y. Characterization of serotonin receptors in pregnant human myometrium [Текст] / Y. Cordeaux, D. Pasupathy, J. Bacon, D. S. CharnockJones, G. C. Smith // J Pharmacol Exp Ther. 2009. Vol. 328, № 3. Р. 682691.8.Курский,М.Д. Биохимические основы механизма действия серотонина [Текст] / М. Д. Курский, Н. С. Бакшеев. Киев: Издво Наукова думка, 1974. 296 с.9.Володченко, А.И. Механизм изменения скорости агглютинации эритроцитов человека под влиянием адреналина [Текст] / А. И. Володченко, В. И. Циркин, А. А. Костяев // Физиология человека. 2014. Т. 40, № 2. С. 6774.10.Володченко, А.И. Изменение скорости адренозависимой агглютинации эритроцитов у женщин на различных этапах репродуктивного процесса [Текст] / А. И. Володченко, В.И. Циркин, С. В. Хлыбова, С. Л. Дмитриева // Российский вестник акушерагинеколога. 2013. Т. 13, № 6. С. 1015.11.Циркин, В.И. Механизм повышения скорости агглютинации эритроцитов человека под влиянием адреналина и его связь с эритроцитозом [Текст] /В. И. Циркин, А. Д. Ноздрачев, А. И. Володченко // Доклады Академии наук. 2013. Т. 451, № 4. С. 464467.12.Безмельцева, О. М. Влияние окситоцина на скорость агглютинации эритроцитов человека, индуцированной изогемагглютинирующей сывороткой [Текст] / О. М. Безмельцева [и др.] // Медицинский альманах. 2014, № 5. С. 7174.13.Критерий ШапироУилка. Режим доступа :http://www.nsu.ru/mmf/tvims/arkashov/calc/Stat/Shapiro/Shapiro.html14.Гланц, С. Медикобиологическая статистика [Текст] / С. Гланц; пер. с англ.М., Практика, 1999. 459 с.
