Взаимодействие Listeria monocytogenes c агрокультурами и стадии формирования биопленки
ART 55233
УДК
001
А.
А. ОводБиблиографическое описание статьи для цитирования:
Овод
А.
А.,
Пушкарева
В.
И.,
Годова
Г.
В. Взаимодействие Listeria monocytogenes c агрокультурами и стадии формирования биопленки // Научно-методический электронный журнал «Концепт». –
2014. – Т. 20. – С.
4841–4845. – URL:
http://e-koncept.ru/2014/55233.htm.
Аннотация. На моделях каллусов пекинской капусты и листового салата изучены стадии формирования биопленок Listeria monocytogenes EGD и его аттенуированного мутанта, лишенного листериолизина О – L. monocytogenes Δ hly. Методами световой и сканирующей электронной микроскопии выявлено, что биопленки на поверхности каллусов формируются чрезвычайно быстро (18-24 часа). При формировании биопленок листериями на неорганической поверхности образуется менее тонкий слой матрикса, при этом отмечен гетероморфизм культур листерий. Гистологические исследования инфицированных каллусов выявили фитопатогенное воздействие на модельные растения L. monocytogenes EGD, в отличие от L. monocytogenes Δ hly. Контаминация овощных культур вирулентными листериями представляет потенциальную эпидемиологическую угрозу.
Текст статьи
Овод Артём Артурович, младший научный сотрудник ФГБУ Научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи Н.Ф. министерства здравоохранения РФ, г. Москваbelosom@rambler.ru
Пушкарева Валентина Ивановна,
докторбиологическихнаук, вед. научн. сотр. лаб. экологии возбудителей инфекций ФГБУ Научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологииим. Гамалеи Н.Ф. министерства здравоохранения РФ, г. Москва
Годова Галина Владимировна,кандидат биологических наук, доцент каф. микробиологии и иммунологииРоссийский государственный аграрный университет –МСХА имени К.А.Тимирязева, г. Москва
Взаимодействие Listeriamonocytogenescагрокультурами и стадииформирования биопленки
Аннотация. На моделях каллусов пекинской капусты и листового салата изучены стадии формирования биопленок ListeriamonocytogenesEGDи его аттенуированного мутанта, лишенного листериолизина О –L. monocytogenesΔ hly. Методами световой и сканирующей электронной микроскопии выявлено, что биопленки на поверхности каллусов формируются чрезвычайно быстро (1824 часа). При формировании биопленок листериями на неорганической поверхности образуется менее тонкий слой матрикса, при этом отмечен гетероморфизм культур листерий. Гистологические исследования инфицированных каллусов выявили фитопатогенное воздействие на модельные растения L. monocytogenesEGD, в отличие от L. monocytogenesΔ hly. Контаминация овощных культур вирулентными листериями представляетпотенциальную эпидемиологическую угрозу.Ключевые слова: биопленки, Listeriamonocytogenes, каллусы, листериолизин О.
Теоретические предпосылкио патогенных бактериях, общих для млекопитающих и растений, были сформулированы В.Ю. Литвиным [5, 6] еще в 90х гг. прошлого века, однако доказательной экспериментальной базы на то время не имелось, поэтому развитие данного направления началось лишь в последние десятилетия, причем, независимо в разных странах –преимущественно в США, а также в России [9, 6, 2, 8,1, 12].Листериоз –тяжелое инфекционное заболевание животных и людей, по современным представлениям, относящееся к классу сапронозов (сапрозоонозов) с высокой летальностью –от 26 до 43% [14,15,17]. Listeriamonocytogenes–грамположительные факультативноанаэробные палочки с весьма небольшим набором факторов патогенности (7 белков), основным из которых является белок листериолизин О, синтезирующийся благодаря гену hlyA, который воздействует на цитоплазматическую мембрану клеток как высших, так и низших эукариот (простейших) [10].
Для листерий характерна убиквитарность: они распространены в различных почвах, богатых гумусом, соленых и пресных водоемах, сточных водах; регулярно выделяются из гидробионтов, от домашних и диких животных –овец, крупного рогатого скота, свиней, собак, кошек, грызунов, что свидетельствует о полигостальности возбудителя. Поскольку основным природным резервуаром листерий, как и других возбудителей сапронозов, служат почвы и водоемы [7,9], межпопуляционные взаимоотношения в их биоценозах наиболее значимы для циркуляции и резервации данных микроорганизмов.Поскольку основной путь заражения листериозом –алиментарный, среди факторов передачи мясные изделия превалируют, однако роль сыров, рыбных продуктов и овощейдоказана при расшифровке ряда эпидемических вспышек [13], причем возбудители пищевых инфекций формируют биопленки на продуктах питания, что представляет особую эпидемиологическую опасность [11].Изучение биопленок как самостоятельное направление в микробиологии началось благодаря появлению нового поколения микроскопов –сканирующего электронного и конфокального сканирующего лазерного (КСЛМ). Последний позволяет получать трехмерное изображение моно и поливидовых биопленок, формируемых различными микроорганизмами, в режиме реального времени [16].
В последние годы хорошо изучен патогенез листериозной инфекции, связанный с наличием гена hly, кодирующего листериолизин, который воздействует на цитоплазматическую мембрану клеток как высших, так и низших эукариот (простейших) [1,9].
Известно, что интерналин А белок, участвующий в индукции фагоцитоза, влияет на эффективность формирования биопленок при взаимодействии листерий с клетками млекопитающих. Однако остаются неизвестными молекулярные механизмы, имеющие значение при взаимодействии листерий и отдельных белков с растительными клетками при формировании ранних биопленок. Предполагается, что растения, синтезирующие аттрактанты (гидрофильные аминокислоты, углеводы, фитогормоны, ферменты и пр.), могут инициировать образование биопленок на поверхностных структурах растительных тканей.Представляется важным изучение биопленоквозбудителей пищевых инфекций на овощах, не подлежащих тепловой обработкев условиях, имитирующих пищевое производство.Цель данной работы изучение взаимодействия Listeriamonocytogenesс растительными клетками на популяционном и клеточном уровнях, а также возможности формирования биопленки на каллусах овощных культур.В экспериментах использованы: вирулентный штамм L. monocytogenesEGDeи его делетированный мутант Δ hlyс удаленным фактором патогенности –листериолизином О [18]. Листерии культивировали на жидкой и плотной среде BHI(Difco), а при высевах из каллусов –на селективной среде Palkam(Himedia) при температуре300С в течение 1 –3х суток.Идентификацию и биохимические свойства изолятов листерий из растительных тканей оценивали на тестсистемах APIListeria(Bio–Merieux).При сомнительных результатах посевов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с парой праймеров Prs1 –Prs2, являющимися родоспецифическими, направляющими амплификацию фрагментагена prs, кодирующего белок фосфорибозилпирофосфатсинтазу, необходимый в общем метаболизме бактериальной клетки, не связанный с патогенностью. Нуклеотидные последовательности Prs1: gcattgcgtgaagctggcgcaac; Prs2: cagaagcattttcatgaac. Продукт длиной 220 н.п. получается в ПЦР со всеми Listeriaspp.Каллусы разных видов капусты и листового салата выращивали на среде Мурасиге –Скуга [4] в чашках Петри при влажности воздуха 70%, освещенности 5000 люкс в течение 30 суток. Масса посадочного инокулюма растительных клеток составляла 0,25г.Для изучения формирования биопленки на каллусных культурах пробоподготовку контаминированных образцов (106м.к./г) осуществляли путем фиксации по ItoKarnovsky, с последующим напылениемслоя золота или углерода толщиной 5 nmс помощью напылительной установки (SPIInc, США). Препараты анализировались в двулучевом электронном микроскопе Quanta200 3D(FEICompani, США).Заражение каллусов длябактериологических исследований проводили с помощью шприца, вводя бактериальную суспензию в агар под каждый каллус в дозе 10 7 м.к./мл. В качестве контроля оставляли каллусы, под которые вводили по 1,0 мл изотонического раствора NaCl. Посевы исследовали в динамике (через 1–3–5–7 суток после заражения клеточных культур) путем высева суспензии из гомогенизированных в изотоническом растворехлористого натрия каллусов (DisperserT10 basicIKA, Германия)на селективную среду для количественного учета листерий по КОЕ. Перед измельчением каждый каллус отмывали гентамицином (100 мкг/г) для элиминации наружных контаминантов с последующим отмыванием от антибиотика изотоническим раствором.Для гистологических исследований каллусных тканей фиксация образцов осуществлялась в течение 3х суток при комнатной температурев растворе уксусной кислоты и 95%ного этилового спирта в соотношении 3:1, с последующей промывкой тканей в дистиллированной воде. Затем следовала проводка образцов через «батарею спиртов» от 70 до 96 0С для обезвоживания. После обработки смолами и отвердителями образцы подвергались резке на микротоме Reichertjung(Германия), после чего полученные срезы препарата помещались на предметное стекло и подсушивались в течение 5 мин. Микроскопические исследования образцов проводили в проходящем светес помощью микроскопа AxioImagerМ1 (Zeiss, Германия) при максимальном увеличении х2000. Микрофотоснимки сделаны цифровой камерой AxioCamMRmи обработаны с использованием программы AxioVision.
Статистическая обработка проводилась по программе MicrosoftOfficeExcel2007 (Microsoft, 2007).Ранее доказано, чтоэпидемиологическую опасность представляют не единичные бактерии –возбудители пищевых инфекций, а их сообщества, колонизирующие различные продукты питания, размножаясь на их поверхности и, формируя устойчивые биопленки [3,11], поэтому необходимо было выявить механизм прикрепления (адгезии) листерий к растительным тканям овощных культур на модели листового салата.
При контаминации каллусов культурой листерий обоих штаммов (вирулентного и аттенуированного) уже через 18–24 часа можно наблюдать начальный этап формирования биопленки –адгезию бактерий, неравноценную на различных участках тканей (от нескольких десятков до нескольких тысяч клеток). Заметны отдельные фрагменты ранней биопленки. Морфологических изменений листерий на данныхобразцах отмечено не было (фото 1).
Фото 1. Формирование биопленки листериями на каллусах:АL.monocytogenes EGD, Б
L.monocytogenes Δhly
Зафиксирована активная колонизация каллусных клеток листериями, заполнившими не только поверхностные структуры растительных тканей, но и межклеточные каналы. Биопленочный матрикс более выражен, заметны делящиеся листерии, что свидетельствует о максимальнойчисленности популяции. Следует отметить на некоторых клетках инвагинации клеточных стенок, что, повидимому, является следствием токсического воздействия листерий EGDна клеткихозяева. Анализ многочисленных снимков позволил выявить, что «неполноценные» листерии, лишенные листериолизина обладали такой же способностью адгезировать поверхность растений.Визуальный ряд интактных каллусов (контроль) демонстрирует скопление клеток на плотной питательной среде: каллусная культурагетерогенна и представлена как молодыми клетками, так и более старыми, о чем свидетельствуют их размеры и форма (вытянутая, округлая, многогранная). Отдельные клетки каллусной ткани имеют большую вакуоль, которая занимает примерно 70% от общего объема (фото 2).
Фото 2. Контроль. Ортогональная проекция каллусовДля гистологических исследований взаимодействие изогенных штаммов листерий с растительными тканями агрокультур исследовали в динамике: через 18, 24 и 36 часов после заражения. В первые сутки морфологиякаллусов, зараженных L. monocytogenesобоих штаммов оставалась сходной. Контрольная культура была представлена морфологически гетерогенными клетками, с четко выраженной Участки с аморфными пористыми массамиАБклеточной стенкой толщиной около 1мкм. Большую часть клетки занимала цитоплазма, а на некоторых срезах видны хлоропласты и ядро. Однако уже в ранние сроки отмечено проникновение как вирулентных, так и аттенуированных листерий в межклеточное пространство без повреждения клетокхозяев.
В более поздние сроки (48–72 часа) ситуация претерпевала значительныеизменения. При взаимодействии с патогенными листериями растительные клетки значительно увеличивались в размерах (фото 3), существенно деформировались, истончались клеточные стенки, которые образовывали значительное число выпячиваний, либо втягиваний стенок внутрь клеткихозяина. Повидимому, вначале клетки листерий были адгезированы на стенках клеток каллусной культуры, далее листерии проникали внутрь растительных клеток путем разрушения их стенок и локализовались внутри вакуолей.При значительном скоплении листерий наблюдалось полное разрушение каллусных клеток. Ответная реакция растительных клеток на вторжение в них листерий заключалась в формировании электронноплотных участков в цитоплазме. Считается, что это происходит при синтезе определенных липидов,а также фенольных веществ, образуемых растительными клетками в стрессовых ситуациях, в данном случае при участии L. monocytogenes.
Фото 3. L. monocytogenesEGDв толще каллусной ткани (32 мкм): 1 –фенольные комплексы; 2 –листерии; 3 –отслоение цитоплазмы от клеточной стенки; 4 –деградация клеточных стенок
При исследовании взаимоотношений аттенуированного штамма листерий с растительными клетками выявлена локализация бактерий как в межклеточном пространстве, так и внутри каллусных клеток, но без цитопатогенного эффекта (фото 4). Таким образом, взаимодействие патогенных листерий с клетками каллуса, исследованное методами СЭМ, микроскопии в проходящем свете, выявило цитопатогенное воздействие бактерий, не относящихся к паразитам растений, однако вызывающие тяжелые инфекции у человека и животных при алиментарном пути заражения.1234Фото 4.L. monocytogenesΔhlyв толще каллусной ткани ( 32мкм): 1 –неразрушенная клетка с внутриклеточными листериями; 2 –межклеточные листерииНапротив, аттенуированный штамм, не оказывал фитопатогенного воздействия на растительные клетки, хотя бактерии проникали в межклеточное пространство.
Ссылки на источники1.Годова Г.В., Пушкарева В.И., Калашникова Е.А. и др. Овощные растения как возможные резервуары листерий. Известия ТСХА. 2009.Вып.4. С. 8089.2.Годова Г.В., Туманова О.В. Персистенция сальмонелл в ризосфере и растениях. //Доклады ТСХА. 2007. Вып.279. Ч.2. С.187190.3.Дробященко М.А., Пушкарева В.И. Возможная роль субстратов агрокомплекса в заражении свиней иерсиниозов.// Ветеринария. 2011. №6. С.3335.4.Калашникова Е.А., Кочиева Е.З., Миронова О.Ю. Практикум посельскохозяйственной биотехнологии.2006. М: Колос. 154с.5.Литвин В.Ю., Пушкарева В.И. Факторы патогенности бактерий:функции вокружающей среде. // ЖМЭИ. Прилож.1. 1994. С.8387.6.
Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И. и др.Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. // 1998. Москва. Фармаруспринт. 257с.7.Литвин В.Ю., Сомов Г.П., Пушкарева В.И. Сапронозы как природноочаговые болезни. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика .2010.№1.С.1016.8.Персиянова Е.В. Характеристика взаимоотношений Yersiniapseudotuberculosis с растительными клетками: Автореф. дисс. канд.биол.наук. Владивосток. 2008.22 с.9.Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах. Дисс. докт. биол. наук. М. 1994. 220с.10.Пушкарева В.И., Ермолаева С.А., Литвин В.Ю. Патогенные листерии и почвенные простейшие: сопряженность жизненных циклов. // Успехи совр. Биологии. 2008. Т.128. №3. С.245251.11.Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Дробященко М.А. Эпидемиологическая опасность формирования биопленок в условиях пищевого производства // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011. №2. С.1723.12.Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Ермолаева С.А. Растения как резервуар и источник возбудителей пищевых инфекций. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2012. №2. С.1020.13.Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. // 2002. М. «Медицина для всех». 195с.14.
Dreux N.C. Fate of Listeria spp. on parsley leaves grown in laboratory andfield cultures // J. Appl. Microbiol. 2007. Vol. 103. P. 1821 –1827.15.Farber J.M., Peterkin P.I. Listeria monocytogenes a food –borne pathogen // Microbiol. 1991. Rev.55. Р. 476511.16.Gazzola S., Cocconcelli P.S. Vancomycin heteresistance and biofilm formation in Staphylococcus epidermidis from food // Microbiology. 2008. №154. P. 3224 3231.17.Slutsker L., Evans M.C., Schuchat A., 2000. p.83106. Listeriosis. ASM Press, Washington.18.VazquezBoland J.A., Kuhn M., Berche P. // Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants, 2001. Clin.Microbial. Rev. 14: 584640.
21Ovod A.A. N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry ofHealth Development of the Russian Federation, MoscowPushkareva V.I., N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry ofHealth Development of the Russian Federation, MoscowGodova G.V., K.A.Timiryazeva Russian State of Agrarian University –Moscow agricultural of Academy, Ministry of Agriculture of the Russian Federation, Moscow.Interactions of Listeria monocytogenes with agriculture and the stage of biofilm formationAbstract.The models of beijing cabbage calluses and lettuce are used to study the stages ofbiofilms Listeria monocytogenes EGD formation and is attenuative mutant with the lost oflisteriolisine O Listeria monocytogenesΔhly. By light and scanning electron microscopy revealed that the biofilm on the surface of the callus formed extremely fast (1824 hours). During the formation of biofilms by Listeria inorganic surface is formed at least a thin layer of the matrix, with marked heteromorphism cultures of Listeria. Histological studies showed positive calluses phytopathogenic effects on model of plants L. monocytogenes EGD, unlike L. monocytogenes Δhly. Contamination of vegetable cultures virulencelisteria poses potential epidemiological dangerous.Key words: biofilms, Listeria monocytogenes, calluses, listeriolisine O
Пушкарева Валентина Ивановна,
докторбиологическихнаук, вед. научн. сотр. лаб. экологии возбудителей инфекций ФГБУ Научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологииим. Гамалеи Н.Ф. министерства здравоохранения РФ, г. Москва
Годова Галина Владимировна,кандидат биологических наук, доцент каф. микробиологии и иммунологииРоссийский государственный аграрный университет –МСХА имени К.А.Тимирязева, г. Москва
Взаимодействие Listeriamonocytogenescагрокультурами и стадииформирования биопленки
Аннотация. На моделях каллусов пекинской капусты и листового салата изучены стадии формирования биопленок ListeriamonocytogenesEGDи его аттенуированного мутанта, лишенного листериолизина О –L. monocytogenesΔ hly. Методами световой и сканирующей электронной микроскопии выявлено, что биопленки на поверхности каллусов формируются чрезвычайно быстро (1824 часа). При формировании биопленок листериями на неорганической поверхности образуется менее тонкий слой матрикса, при этом отмечен гетероморфизм культур листерий. Гистологические исследования инфицированных каллусов выявили фитопатогенное воздействие на модельные растения L. monocytogenesEGD, в отличие от L. monocytogenesΔ hly. Контаминация овощных культур вирулентными листериями представляетпотенциальную эпидемиологическую угрозу.Ключевые слова: биопленки, Listeriamonocytogenes, каллусы, листериолизин О.
Теоретические предпосылкио патогенных бактериях, общих для млекопитающих и растений, были сформулированы В.Ю. Литвиным [5, 6] еще в 90х гг. прошлого века, однако доказательной экспериментальной базы на то время не имелось, поэтому развитие данного направления началось лишь в последние десятилетия, причем, независимо в разных странах –преимущественно в США, а также в России [9, 6, 2, 8,1, 12].Листериоз –тяжелое инфекционное заболевание животных и людей, по современным представлениям, относящееся к классу сапронозов (сапрозоонозов) с высокой летальностью –от 26 до 43% [14,15,17]. Listeriamonocytogenes–грамположительные факультативноанаэробные палочки с весьма небольшим набором факторов патогенности (7 белков), основным из которых является белок листериолизин О, синтезирующийся благодаря гену hlyA, который воздействует на цитоплазматическую мембрану клеток как высших, так и низших эукариот (простейших) [10].
Для листерий характерна убиквитарность: они распространены в различных почвах, богатых гумусом, соленых и пресных водоемах, сточных водах; регулярно выделяются из гидробионтов, от домашних и диких животных –овец, крупного рогатого скота, свиней, собак, кошек, грызунов, что свидетельствует о полигостальности возбудителя. Поскольку основным природным резервуаром листерий, как и других возбудителей сапронозов, служат почвы и водоемы [7,9], межпопуляционные взаимоотношения в их биоценозах наиболее значимы для циркуляции и резервации данных микроорганизмов.Поскольку основной путь заражения листериозом –алиментарный, среди факторов передачи мясные изделия превалируют, однако роль сыров, рыбных продуктов и овощейдоказана при расшифровке ряда эпидемических вспышек [13], причем возбудители пищевых инфекций формируют биопленки на продуктах питания, что представляет особую эпидемиологическую опасность [11].Изучение биопленок как самостоятельное направление в микробиологии началось благодаря появлению нового поколения микроскопов –сканирующего электронного и конфокального сканирующего лазерного (КСЛМ). Последний позволяет получать трехмерное изображение моно и поливидовых биопленок, формируемых различными микроорганизмами, в режиме реального времени [16].
В последние годы хорошо изучен патогенез листериозной инфекции, связанный с наличием гена hly, кодирующего листериолизин, который воздействует на цитоплазматическую мембрану клеток как высших, так и низших эукариот (простейших) [1,9].
Известно, что интерналин А белок, участвующий в индукции фагоцитоза, влияет на эффективность формирования биопленок при взаимодействии листерий с клетками млекопитающих. Однако остаются неизвестными молекулярные механизмы, имеющие значение при взаимодействии листерий и отдельных белков с растительными клетками при формировании ранних биопленок. Предполагается, что растения, синтезирующие аттрактанты (гидрофильные аминокислоты, углеводы, фитогормоны, ферменты и пр.), могут инициировать образование биопленок на поверхностных структурах растительных тканей.Представляется важным изучение биопленоквозбудителей пищевых инфекций на овощах, не подлежащих тепловой обработкев условиях, имитирующих пищевое производство.Цель данной работы изучение взаимодействия Listeriamonocytogenesс растительными клетками на популяционном и клеточном уровнях, а также возможности формирования биопленки на каллусах овощных культур.В экспериментах использованы: вирулентный штамм L. monocytogenesEGDeи его делетированный мутант Δ hlyс удаленным фактором патогенности –листериолизином О [18]. Листерии культивировали на жидкой и плотной среде BHI(Difco), а при высевах из каллусов –на селективной среде Palkam(Himedia) при температуре300С в течение 1 –3х суток.Идентификацию и биохимические свойства изолятов листерий из растительных тканей оценивали на тестсистемах APIListeria(Bio–Merieux).При сомнительных результатах посевов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с парой праймеров Prs1 –Prs2, являющимися родоспецифическими, направляющими амплификацию фрагментагена prs, кодирующего белок фосфорибозилпирофосфатсинтазу, необходимый в общем метаболизме бактериальной клетки, не связанный с патогенностью. Нуклеотидные последовательности Prs1: gcattgcgtgaagctggcgcaac; Prs2: cagaagcattttcatgaac. Продукт длиной 220 н.п. получается в ПЦР со всеми Listeriaspp.Каллусы разных видов капусты и листового салата выращивали на среде Мурасиге –Скуга [4] в чашках Петри при влажности воздуха 70%, освещенности 5000 люкс в течение 30 суток. Масса посадочного инокулюма растительных клеток составляла 0,25г.Для изучения формирования биопленки на каллусных культурах пробоподготовку контаминированных образцов (106м.к./г) осуществляли путем фиксации по ItoKarnovsky, с последующим напылениемслоя золота или углерода толщиной 5 nmс помощью напылительной установки (SPIInc, США). Препараты анализировались в двулучевом электронном микроскопе Quanta200 3D(FEICompani, США).Заражение каллусов длябактериологических исследований проводили с помощью шприца, вводя бактериальную суспензию в агар под каждый каллус в дозе 10 7 м.к./мл. В качестве контроля оставляли каллусы, под которые вводили по 1,0 мл изотонического раствора NaCl. Посевы исследовали в динамике (через 1–3–5–7 суток после заражения клеточных культур) путем высева суспензии из гомогенизированных в изотоническом растворехлористого натрия каллусов (DisperserT10 basicIKA, Германия)на селективную среду для количественного учета листерий по КОЕ. Перед измельчением каждый каллус отмывали гентамицином (100 мкг/г) для элиминации наружных контаминантов с последующим отмыванием от антибиотика изотоническим раствором.Для гистологических исследований каллусных тканей фиксация образцов осуществлялась в течение 3х суток при комнатной температурев растворе уксусной кислоты и 95%ного этилового спирта в соотношении 3:1, с последующей промывкой тканей в дистиллированной воде. Затем следовала проводка образцов через «батарею спиртов» от 70 до 96 0С для обезвоживания. После обработки смолами и отвердителями образцы подвергались резке на микротоме Reichertjung(Германия), после чего полученные срезы препарата помещались на предметное стекло и подсушивались в течение 5 мин. Микроскопические исследования образцов проводили в проходящем светес помощью микроскопа AxioImagerМ1 (Zeiss, Германия) при максимальном увеличении х2000. Микрофотоснимки сделаны цифровой камерой AxioCamMRmи обработаны с использованием программы AxioVision.
Статистическая обработка проводилась по программе MicrosoftOfficeExcel2007 (Microsoft, 2007).Ранее доказано, чтоэпидемиологическую опасность представляют не единичные бактерии –возбудители пищевых инфекций, а их сообщества, колонизирующие различные продукты питания, размножаясь на их поверхности и, формируя устойчивые биопленки [3,11], поэтому необходимо было выявить механизм прикрепления (адгезии) листерий к растительным тканям овощных культур на модели листового салата.
При контаминации каллусов культурой листерий обоих штаммов (вирулентного и аттенуированного) уже через 18–24 часа можно наблюдать начальный этап формирования биопленки –адгезию бактерий, неравноценную на различных участках тканей (от нескольких десятков до нескольких тысяч клеток). Заметны отдельные фрагменты ранней биопленки. Морфологических изменений листерий на данныхобразцах отмечено не было (фото 1).
Фото 1. Формирование биопленки листериями на каллусах:АL.monocytogenes EGD, Б
L.monocytogenes Δhly
Зафиксирована активная колонизация каллусных клеток листериями, заполнившими не только поверхностные структуры растительных тканей, но и межклеточные каналы. Биопленочный матрикс более выражен, заметны делящиеся листерии, что свидетельствует о максимальнойчисленности популяции. Следует отметить на некоторых клетках инвагинации клеточных стенок, что, повидимому, является следствием токсического воздействия листерий EGDна клеткихозяева. Анализ многочисленных снимков позволил выявить, что «неполноценные» листерии, лишенные листериолизина обладали такой же способностью адгезировать поверхность растений.Визуальный ряд интактных каллусов (контроль) демонстрирует скопление клеток на плотной питательной среде: каллусная культурагетерогенна и представлена как молодыми клетками, так и более старыми, о чем свидетельствуют их размеры и форма (вытянутая, округлая, многогранная). Отдельные клетки каллусной ткани имеют большую вакуоль, которая занимает примерно 70% от общего объема (фото 2).
Фото 2. Контроль. Ортогональная проекция каллусовДля гистологических исследований взаимодействие изогенных штаммов листерий с растительными тканями агрокультур исследовали в динамике: через 18, 24 и 36 часов после заражения. В первые сутки морфологиякаллусов, зараженных L. monocytogenesобоих штаммов оставалась сходной. Контрольная культура была представлена морфологически гетерогенными клетками, с четко выраженной Участки с аморфными пористыми массамиАБклеточной стенкой толщиной около 1мкм. Большую часть клетки занимала цитоплазма, а на некоторых срезах видны хлоропласты и ядро. Однако уже в ранние сроки отмечено проникновение как вирулентных, так и аттенуированных листерий в межклеточное пространство без повреждения клетокхозяев.
В более поздние сроки (48–72 часа) ситуация претерпевала значительныеизменения. При взаимодействии с патогенными листериями растительные клетки значительно увеличивались в размерах (фото 3), существенно деформировались, истончались клеточные стенки, которые образовывали значительное число выпячиваний, либо втягиваний стенок внутрь клеткихозяина. Повидимому, вначале клетки листерий были адгезированы на стенках клеток каллусной культуры, далее листерии проникали внутрь растительных клеток путем разрушения их стенок и локализовались внутри вакуолей.При значительном скоплении листерий наблюдалось полное разрушение каллусных клеток. Ответная реакция растительных клеток на вторжение в них листерий заключалась в формировании электронноплотных участков в цитоплазме. Считается, что это происходит при синтезе определенных липидов,а также фенольных веществ, образуемых растительными клетками в стрессовых ситуациях, в данном случае при участии L. monocytogenes.
Фото 3. L. monocytogenesEGDв толще каллусной ткани (32 мкм): 1 –фенольные комплексы; 2 –листерии; 3 –отслоение цитоплазмы от клеточной стенки; 4 –деградация клеточных стенок
При исследовании взаимоотношений аттенуированного штамма листерий с растительными клетками выявлена локализация бактерий как в межклеточном пространстве, так и внутри каллусных клеток, но без цитопатогенного эффекта (фото 4). Таким образом, взаимодействие патогенных листерий с клетками каллуса, исследованное методами СЭМ, микроскопии в проходящем свете, выявило цитопатогенное воздействие бактерий, не относящихся к паразитам растений, однако вызывающие тяжелые инфекции у человека и животных при алиментарном пути заражения.1234Фото 4.L. monocytogenesΔhlyв толще каллусной ткани ( 32мкм): 1 –неразрушенная клетка с внутриклеточными листериями; 2 –межклеточные листерииНапротив, аттенуированный штамм, не оказывал фитопатогенного воздействия на растительные клетки, хотя бактерии проникали в межклеточное пространство.
Ссылки на источники1.Годова Г.В., Пушкарева В.И., Калашникова Е.А. и др. Овощные растения как возможные резервуары листерий. Известия ТСХА. 2009.Вып.4. С. 8089.2.Годова Г.В., Туманова О.В. Персистенция сальмонелл в ризосфере и растениях. //Доклады ТСХА. 2007. Вып.279. Ч.2. С.187190.3.Дробященко М.А., Пушкарева В.И. Возможная роль субстратов агрокомплекса в заражении свиней иерсиниозов.// Ветеринария. 2011. №6. С.3335.4.Калашникова Е.А., Кочиева Е.З., Миронова О.Ю. Практикум посельскохозяйственной биотехнологии.2006. М: Колос. 154с.5.Литвин В.Ю., Пушкарева В.И. Факторы патогенности бактерий:функции вокружающей среде. // ЖМЭИ. Прилож.1. 1994. С.8387.6.
Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И. и др.Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. // 1998. Москва. Фармаруспринт. 257с.7.Литвин В.Ю., Сомов Г.П., Пушкарева В.И. Сапронозы как природноочаговые болезни. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика .2010.№1.С.1016.8.Персиянова Е.В. Характеристика взаимоотношений Yersiniapseudotuberculosis с растительными клетками: Автореф. дисс. канд.биол.наук. Владивосток. 2008.22 с.9.Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах. Дисс. докт. биол. наук. М. 1994. 220с.10.Пушкарева В.И., Ермолаева С.А., Литвин В.Ю. Патогенные листерии и почвенные простейшие: сопряженность жизненных циклов. // Успехи совр. Биологии. 2008. Т.128. №3. С.245251.11.Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Дробященко М.А. Эпидемиологическая опасность формирования биопленок в условиях пищевого производства // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011. №2. С.1723.12.Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Ермолаева С.А. Растения как резервуар и источник возбудителей пищевых инфекций. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2012. №2. С.1020.13.Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. // 2002. М. «Медицина для всех». 195с.14.
Dreux N.C. Fate of Listeria spp. on parsley leaves grown in laboratory andfield cultures // J. Appl. Microbiol. 2007. Vol. 103. P. 1821 –1827.15.Farber J.M., Peterkin P.I. Listeria monocytogenes a food –borne pathogen // Microbiol. 1991. Rev.55. Р. 476511.16.Gazzola S., Cocconcelli P.S. Vancomycin heteresistance and biofilm formation in Staphylococcus epidermidis from food // Microbiology. 2008. №154. P. 3224 3231.17.Slutsker L., Evans M.C., Schuchat A., 2000. p.83106. Listeriosis. ASM Press, Washington.18.VazquezBoland J.A., Kuhn M., Berche P. // Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants, 2001. Clin.Microbial. Rev. 14: 584640.
21Ovod A.A. N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry ofHealth Development of the Russian Federation, MoscowPushkareva V.I., N.F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry ofHealth Development of the Russian Federation, MoscowGodova G.V., K.A.Timiryazeva Russian State of Agrarian University –Moscow agricultural of Academy, Ministry of Agriculture of the Russian Federation, Moscow.Interactions of Listeria monocytogenes with agriculture and the stage of biofilm formationAbstract.The models of beijing cabbage calluses and lettuce are used to study the stages ofbiofilms Listeria monocytogenes EGD formation and is attenuative mutant with the lost oflisteriolisine O Listeria monocytogenesΔhly. By light and scanning electron microscopy revealed that the biofilm on the surface of the callus formed extremely fast (1824 hours). During the formation of biofilms by Listeria inorganic surface is formed at least a thin layer of the matrix, with marked heteromorphism cultures of Listeria. Histological studies showed positive calluses phytopathogenic effects on model of plants L. monocytogenes EGD, unlike L. monocytogenes Δhly. Contamination of vegetable cultures virulencelisteria poses potential epidemiological dangerous.Key words: biofilms, Listeria monocytogenes, calluses, listeriolisine O
